JAK2激酶小分子抑制劑在胃癌治療中的作用及其分子機(jī)制.pdf

1、胃癌是全世界最常見的、致死率極高的惡性腫瘤之一。隨著醫(yī)學(xué)的不斷進(jìn)步，胃癌的診斷和治療手段已經(jīng)取得了巨大的發(fā)展，但是，我國(guó)早期胃癌的檢出率很低，一般為10％左右。進(jìn)展期胃癌的治療策略以綜合治療為主，其預(yù)后仍然很差，5年生存率徘徊在20％-30％左右。隨著胃癌相關(guān)的細(xì)胞生物學(xué)和分子生物學(xué)研究的不斷深入，針對(duì)腫瘤細(xì)胞生長(zhǎng)、凋亡、細(xì)胞周期等分子生物靶點(diǎn)提出的分子靶向治療成為了胃癌綜合治療的迫切要求和研究熱點(diǎn)。
　　JAK2激酶是JAK家族

2、成員之一，許多研究表明，JAK2信號(hào)通路的異?；罨c多種腫瘤的發(fā)生發(fā)展有關(guān)，如結(jié)腸癌、頭頸部癌、肺癌、乳腺癌、白血病、淋巴瘤及多發(fā)性骨髓瘤等。目前，關(guān)于JAK2與胃癌的研究較少。我們課題組的前期工作結(jié)果顯示，JAK2可能與胃癌的發(fā)生發(fā)展有關(guān)，JAK2激酶小分子抑制劑可能用于胃癌的臨床治療，但需要深入的研究為其提供理論依據(jù)。
　　本研究將通過體內(nèi)外實(shí)驗(yàn)闡明通過JAK2激酶小分子抑制劑AG490及特異性shRNA靶向沉默JAK2等方法

3、下調(diào)JAK2通路對(duì)胃癌細(xì)胞細(xì)胞增殖、凋亡等生物學(xué)行為的影響及其機(jī)制;并試圖揭示核JAK2信號(hào)通路對(duì)AG490治療胃癌的影響及其機(jī)制，以進(jìn)一步闡明JAK2在胃癌發(fā)生、發(fā)展過程中的作用及分子機(jī)制。
　　研究步驟:
　　1.JAK2在胃癌細(xì)胞系和組織中的表達(dá)情況及與胃癌各病理特征之間的相關(guān)性
　?、倜庖呓M織化學(xué)方法檢測(cè)75對(duì)原發(fā)性胃癌患者的胃癌組織及配對(duì)的癌旁非腫瘤胃粘膜組織中JAK2的表達(dá)及核漿分布情況;
　?、趯?shí)時(shí)

4、定量RT-PCR和Western blot檢測(cè)4株不同分化程度的胃癌細(xì)胞株MKN28、SGC7901、AGS、MKN45以及胃正常上皮來源的細(xì)胞株GES-1中JAK2及pJAK2的mRNA和蛋白表達(dá)水平;
　?、凼褂肧pearman's rho test分析JAK2表達(dá)水平與胃癌臨床各病理參數(shù)之間的相關(guān)性。
　　2.JAK2激酶小分子抑制劑AG490對(duì)胃癌細(xì)胞惡性生物學(xué)行為的影響
　?、費(fèi)TS法檢測(cè)不同濃度的JAK2激

5、酶小分子抑制劑AG490作用胃癌細(xì)胞不同時(shí)間段對(duì)胃癌細(xì)胞增殖的影響;流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)AG490對(duì)胃癌細(xì)胞凋亡的影響;Westernblot檢測(cè)AG490對(duì)胃癌細(xì)胞凋亡及周期相關(guān)蛋白表達(dá)水平的影響;
　?、诮⒙闶笃は潞闪瞿Ｐ?，檢測(cè)AG490對(duì)胃癌細(xì)胞在裸鼠體內(nèi)生長(zhǎng)的影響。
　　3.細(xì)胞核JAK2信號(hào)在AG490誘導(dǎo)的胃癌細(xì)胞凋亡中的作用及機(jī)制
　?、賅estern blot檢測(cè)不同分化程度胃癌細(xì)胞MKN28、SGC790

6、1、AGS、MKN45及胃上皮細(xì)胞GES-1中JAK2的核表達(dá)情況;
　?、赪estern blot檢測(cè)AG490對(duì)SGC7901和AGS細(xì)胞總蛋白、漿蛋白及核蛋白中JAK2及pJAK2表達(dá)水平的影響;應(yīng)用細(xì)胞免疫熒光技術(shù)觀察AG490對(duì)胃癌細(xì)胞中JAK2的表達(dá)和分布情況的影響;
　?、鄄捎妹庖吖渤恋砑夹g(shù)驗(yàn)證JAK2在SGC7901細(xì)胞核中形成JAK2-STAT3-Hes1復(fù)合物;
　?、苡^察Hes1 siRNA聯(lián)合A

7、G490處理對(duì)胃癌細(xì)胞SGC7901細(xì)胞形態(tài)的影響，并采用Caspase3/7活性檢測(cè)和流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)細(xì)胞凋亡的情況。
　　4.特異性JAK2干擾對(duì)SGC7901細(xì)胞惡性生物學(xué)行為的影響及機(jī)制
　?、贅?gòu)建shRNA介導(dǎo)特異性JAK2沉默的胃癌SGC7901穩(wěn)轉(zhuǎn)細(xì)胞株，采用qPCR和Westem blot檢測(cè)JAK2的mRNA和蛋白表達(dá)水平;
　?、诓捎每寺⌒纬蓪?shí)驗(yàn)和MTS實(shí)驗(yàn)觀察JAK2沉默對(duì)SGC7901細(xì)胞增殖的影

8、響;
　?、鄄捎昧魇郊?xì)胞儀檢測(cè)JAK2沉默對(duì)SGC7901細(xì)胞凋亡和細(xì)胞周期的影響;
　?、苈闶笃は潞闪瞿Ｐ陀^察JAK2沉默對(duì)胃癌生長(zhǎng)的影響。
　　5.特異性JAK2干擾聯(lián)合ERK抑制劑對(duì)SGC7901細(xì)胞的體內(nèi)外作用
　?、賅estem blot檢測(cè)JAK2 shRNA轉(zhuǎn)染介導(dǎo)的JAK2下調(diào)對(duì)SGC7901細(xì)胞中ERK1/2表達(dá)及活性的影響;
　?、谂c單獨(dú)應(yīng)用JAK2 shRNA或ERK1/2抑制劑PD9

9、8059相比較，觀測(cè)JAK2 shRNA聯(lián)合PD98059對(duì)SGC7901細(xì)胞增殖、凋亡及細(xì)胞周期的影響;
　　③與單獨(dú)應(yīng)用JAK2 shRNA或ERK1/2抑制劑PD98059相比較，觀測(cè)JAK2 shRNA聯(lián)合PD98059對(duì)SGC7901細(xì)胞裸鼠皮下成瘤的生長(zhǎng)的影響。
　　研究結(jié)果與結(jié)論
　　1.JAK2在胃癌中高表達(dá)，提示其可能起到促癌作用
　?、貸AK2在66.67％(50/75)的胃癌組織中呈高表達(dá);

10、而且，75例胃癌組織的細(xì)胞漿中均可見JAK2的陽性表達(dá)，22例胃癌組織的細(xì)胞核中可見JAK2的陽性表達(dá);
　?、贘AK2的表達(dá)水平與胃癌患者的性別、年齡、腫瘤直徑、浸潤(rùn)深度、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移及UICC分期無關(guān)(p＞0.05);
　?、畚赴┘?xì)胞株MKN28、SGC7901、AGS和MKN45均有JAK2和pJAK2的陽性表達(dá)，其中SGC7901細(xì)胞表達(dá)水平最高;GES-1細(xì)胞中未見明顯pJAK2表達(dá)。
　　2.JAK2激酶小分

11、子抑制劑AG490的抗胃癌作用呈現(xiàn)細(xì)胞選擇性
　?、貯G490呈濃度和時(shí)間依賴性地抑制AGS細(xì)胞的生長(zhǎng)(p＜0.05)，但AG490對(duì)SGC7901細(xì)胞的生長(zhǎng)抑制僅表現(xiàn)為濃度依賴性(p＜0.05);
　?、贏G490引起AGS細(xì)胞發(fā)生顯著的細(xì)胞凋亡，但AG490并未引起SGC7901細(xì)胞出現(xiàn)顯著的細(xì)胞凋亡(p＞0.05);
　?、跘G490對(duì)SGC7901細(xì)胞的裸鼠皮下成瘤的生長(zhǎng)無顯著抑制作用(p＞0.05)。

12、　　3.SGC7901細(xì)胞對(duì)AG490的促凋亡效應(yīng)無應(yīng)答可能與JAK2的核內(nèi)移有關(guān)
　?、傥赴┘?xì)胞株MKN28、SGC7901、AGS和MKN45的細(xì)胞核內(nèi)均能檢測(cè)到不同程度的JAK2和pJAK2的表達(dá)，而GES-1細(xì)胞核中未見pJAK2的表達(dá);
　?、贏G490下調(diào)了AGS細(xì)胞中JAK2的細(xì)胞核表達(dá)，但卻引起SGC7901細(xì)胞核蛋白中JAK2的表達(dá)的顯著升高;
　?、跘G490促進(jìn)SGC7901細(xì)胞核中JAK2-ST

13、AT3-Hes1復(fù)合物的形成，而Hes1 siRNA能抑制該復(fù)合物的形成;
　?、蹾es1 siRNA聯(lián)合AG490能顯著促進(jìn)SGC7901細(xì)胞的凋亡(p＜0.05)。
　　4.JAK2 shRNA干擾介導(dǎo)的JAK2沉默能抑制SGC7901細(xì)胞的增殖，但無促進(jìn)其凋亡的作用
　?、俜€(wěn)定轉(zhuǎn)染了JAK2 shRNA的胃癌細(xì)胞株SGC7901出現(xiàn)了JAK2基因沉默，即JAK2表達(dá)顯著下調(diào)(p＜0.05);
　?、贘AK2

14、沉默抑制SGC7901細(xì)胞增殖是通過引起G2/M期阻滯引起的，而不是通過促進(jìn)細(xì)胞的凋亡;
　?、跩AK2沉默對(duì)SGC7901細(xì)胞的裸鼠皮下成瘤的生長(zhǎng)無顯著抑制作用(p＞0.05)。
　　5.ERK1/2抑制能增強(qiáng)JAK2沉默誘導(dǎo)的抗胃癌作用
　?、貸AK2 shRNA轉(zhuǎn)染沉默JAK2的同時(shí)，顯著活化了ERK1/2;
　?、贘AK2沉默聯(lián)合ERK1/2抑制通過促進(jìn)細(xì)胞凋亡和細(xì)胞周期阻滯發(fā)揮了有效的體內(nèi)外抗腫瘤細(xì)胞生