PI3K抑制劑LY294002誘導(dǎo)卵巢癌SKOV-3細(xì)胞凋亡機(jī)制的研究.pdf

1、目的:PI3K可以促進(jìn)細(xì)胞的生長(zhǎng)、增殖、分裂和遷移，其異常高表達(dá)是卵巢癌進(jìn)展中的重要事件。我們?cè)谇按螌?shí)驗(yàn)中觀察到，PI3K抑制劑LY294002可以引起卵巢癌SKOV-3細(xì)胞凋亡增加;同時(shí)發(fā)現(xiàn)Akt及下游凋亡抑制蛋白(XIAP和cIAP2)的表達(dá)也出現(xiàn)下調(diào)，這提示LY294002的促凋亡效應(yīng)可能與Akt的活性被抑制有關(guān)，但其引起凋亡啟動(dòng)的具體機(jī)制尚不清楚。本實(shí)驗(yàn)使用Annexin V-FITC/PI雙染色法和熒光底物法，分別檢測(cè)LY29

2、4002作用SKOV-3時(shí)的凋亡率變化及凋亡蛋白酶活性，探討PI3K-Akt信號(hào)通路促進(jìn)凋亡的作用機(jī)制，為PI3K小分子抑制劑應(yīng)用于卵巢癌臨床治療提供理論依據(jù)。
　　 方法:本實(shí)驗(yàn)以人卵巢漿液性乳頭狀囊腺癌細(xì)胞系SKOV-3為研究對(duì)象，首先在37℃、5％CO2條件下培養(yǎng)卵巢癌細(xì)胞，選擇其中匯合度達(dá)到70％左右，且生長(zhǎng)良好的細(xì)胞進(jìn)行以下實(shí)驗(yàn)。(1)使用Annexin V-FITC/PI雙染色法通過流式細(xì)胞儀檢測(cè)LY294002以不

3、同濃度(0μM、5μM、10μM、20μM、40μM)作用不同時(shí)間(24h、48h、72h、96h)后細(xì)胞的凋亡率。(2)將正常貼壁生長(zhǎng)的SKOV-3細(xì)胞隨機(jī)分為對(duì)照組和藥物組，藥物組加入適量LY294002使其終濃度達(dá)到40μM;于48h使用熒光底物法通過熒光分光光度計(jì)分別檢測(cè)對(duì)照組和藥物組細(xì)胞中Caspase-3，Caspase-9，Caspase-8的活性。(3)所得數(shù)據(jù)以(x)±s表示，多組間均數(shù)比較采用方差分析，兩組間均數(shù)比較

4、采用配對(duì)樣本t檢驗(yàn)，p＜0.05有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，統(tǒng)計(jì)運(yùn)算使用SPSS17.0。
　　 結(jié)果:(1)不同濃度LY294002(0μM、5μM、10μM、20μM、40μM)作用不同時(shí)間(24h、48h、72h、96h)后的細(xì)胞凋亡率(％):24小時(shí)，1.54、2.20、2.48、3.37、5.13;48小時(shí)，2.35、6.51、7.28、9.62、10.49;72小時(shí)，2.98，6.78，7.73，9.22，12.14;96小時(shí)，3

5、.64，7.23，8.21，11.57，15.43。相同濃度LY294002各時(shí)間組間比較，凋亡率隨時(shí)間延長(zhǎng)而增加，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(p＜0.05);但相同孵育時(shí)間各濃度組間比較，凋亡率表現(xiàn)不一致，當(dāng)以低濃度（5μM、10μM）LY294002孵育24小時(shí)，凋亡率無明顯改變，差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(p＞0.05);當(dāng)孵育時(shí)間超過24小時(shí)(48h、72h、96h)，細(xì)胞凋亡率隨濃度的提高而增加，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(p＜0.05)。(2)LY294

6、002(40μM，48h)作用后caspase-3活性:對(duì)照組為245.22，藥物組為484.78，藥物組熒光強(qiáng)度值高于對(duì)照組(p＜0.05)，即LY294002作用下SKOV-3細(xì)胞中caspase-3的活性高于對(duì)照組。(3) LY294002(40μM，48h)作用后caspase-9活性:對(duì)照組為190.25，藥物組為255.50，藥物組熒光強(qiáng)度值高于對(duì)照組(p＜0.05)，即LY294002作用下SKOV-3細(xì)胞中caspase

7、-9的活性高于對(duì)照組。(4) LY294002(40μM，48h)作用后caspase-8活性:對(duì)照組為99.71，藥物組為98.71，藥物組熒光強(qiáng)度值與對(duì)照組比較，差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(p＞0.05)，即LY294002作用下SKOV-3細(xì)胞中caspase-8的活性與對(duì)照組相比無差別。
　　 結(jié)論:LY294002引起的卵巢癌SKOV-3細(xì)胞凋亡增加，可能是其間接啟動(dòng)凋亡線粒體途徑后引起caspase-9與easpase-3活性