PI3K抑制劑LY294002誘導(dǎo)HESC定向分化為胰島素分泌細(xì)胞的研究.pdf

1、目的：
　　誘導(dǎo)人胚胎干細(xì)胞定向分化為胰島素分泌細(xì)胞是目前生殖生物學(xué)與糖尿病研究領(lǐng)域的前沿課題，它為通過細(xì)胞替代治療糖尿病提供新的途徑。多種誘導(dǎo)方法不斷被嘗試，但獲得細(xì)胞多為不成熟的胰島分泌細(xì)胞前體細(xì)胞。本文探討磷脂酰肌醇3激酶抑制劑LY294002對人胚胎干細(xì)胞(human embryonic stem cells,HESC)定向分化為胰島素分泌細(xì)胞的影響，嘗試獲得功能更加成熟的胰島素分泌細(xì)胞。
　　方法：
　　體外

2、通過五個階段誘導(dǎo)人胚胎干細(xì)胞定向分化為胰島素分泌細(xì)胞。人胚胎干細(xì)胞培養(yǎng)在由3000γ射線滅活的小鼠胚胎成纖維細(xì)胞飼養(yǎng)層上。人胚胎干細(xì)胞培養(yǎng)體系:80％knockout DMEM、20％血清替代品、2mM谷氨酰胺、0.1mM2-巰基乙醇、1％非必須氨基酸和4ng/ml堿性成纖維細(xì)胞生長因子（bFGF）。細(xì)胞融合80％時，用1mg/ml膠原酶IV消化后，轉(zhuǎn)入細(xì)菌培養(yǎng)皿懸浮培養(yǎng)7天形成擬胚體（EB），其培養(yǎng)體系為:DMEM/F12（1:1）、

3、20％血清替代品、2mM谷氨酰胺和1％非必須氨基酸。在無血清培養(yǎng)體系下將形成的EB移至0.1%明膠包被的10cm培養(yǎng)皿中,培養(yǎng)體系：DMEM／F12、2mM谷氨酰胺、5μg/ml纖粘連蛋白和1% ITS，對巢蛋白陽性細(xì)胞進行篩選(ITS)。之后進行巢蛋白陽性細(xì)胞擴增(N2)。最后去除bFGF，分別給予尼克酰胺+B27（B27組）為對照組和尼克酰胺+LY294002(LY組)為實驗組誘導(dǎo)胰島素分泌細(xì)胞的成熟。顯微鏡下觀察各階段細(xì)胞形態(tài)變化

4、，免疫熒光染色分析胰島細(xì)胞特異蛋白的表達(dá)；通過體外胰島素誘導(dǎo)釋放實驗初步評價細(xì)胞的分化及其功能。
　　結(jié)果：
　　通過ITS條件培養(yǎng)液篩選出巢蛋白陽性細(xì)胞，細(xì)胞免疫熒光可呈現(xiàn)細(xì)胞核的胰島素陽性染色和核膜的巢蛋白陽性染色且兩者呈共染狀態(tài)。誘導(dǎo)分化第4階段添加bFGF以后巢蛋白陽性細(xì)胞進入快速增長期，第7天表現(xiàn)為胰島素的核膜染色，細(xì)胞核中心逐漸淡染，巢蛋白逐漸呈現(xiàn)出核膜與細(xì)胞核的全染狀態(tài)。誘導(dǎo)第五階段7天后，LY組胰島素免疫熒光

5、單染陽性率為（82.7±17.5）%高于B27組的（52.6±14.6）%（P<0.05），但LY組生長抑素和胰高血糖素單染陽性率，胰島素/生長抑素共染率和c-肽/胰高血糖素共染率分別低于B27組（P<0.05）。誘導(dǎo)第五階段14天后，LY組胰島素免疫熒光單染陽性率與B27組胰島素單染陽性率差異無統(tǒng)計學(xué)意義，但生長抑素和胰高血糖素單染陽性率，胰島素/生長抑素共染陽性率仍低于B27組（P<0.05）。B27組和LY組各誘導(dǎo)1周以后，在高糖

6、（25mM）DMEM培養(yǎng)液中培養(yǎng)1小時后，LY誘導(dǎo)組細(xì)胞胰島素釋放量高于 B27誘導(dǎo)組，分別為428.3±43.9μIU/ml/mg蛋白及259.2±18.5μIU/ml/mg蛋白，兩組之間差異具有統(tǒng)計學(xué)意義(p<0.05)；2.5小時后， LY誘導(dǎo)組細(xì)胞胰島素釋放量仍高于 B27誘導(dǎo)組細(xì)胞，分別為515.3±24.0μIU/ml/mg蛋白及258.7±17.8μIU/ml/mg蛋白，差異具有統(tǒng)計學(xué)意義(p<0.05)，體外可以檢測到胰