Ad-PTEN聯(lián)合PI3K抑制劑LY294002抑制人膠質瘤細胞系LN229增殖和侵襲的研究.pdf

1、膠質瘤是顱內(nèi)最常見的原發(fā)腫瘤,術后復發(fā)率高,血腦屏障的存在使常規(guī)化療藥物難以發(fā)揮作用,即使采取包括手術、放化療、免疫治療在內(nèi)的綜合治療,預后仍然不佳。膠質瘤的發(fā)生、發(fā)展是多因素作用的結果,與癌基因的激活和抑癌基因的失活密切相關。P13K/AKT(磷酸肌醇3-激酶/絲-蘇氨酸激酶)信號通路與膠質瘤的發(fā)生、發(fā)展密切相關。PTEN(第10號染色體缺失性磷酸酶和張力蛋白同源物基因)是具有磷酸酯酶活性的抑癌基因,能夠拮抗P13K/AKT通路表達。

2、PTEN還通過絲裂原活化蛋白激酶(MPKA)、粘著斑激酶(FAK)等通路參與細胞生長、增殖、遷移、分化等過程。它們都是膠質瘤基因治療的理想靶點。
　　 本課題重點研究了攜帶野生型PTEN基因的重組腺病毒(Ad-PTEN)和P13K的小分子抑制劑(SMIs)LY294002對人腦膠質瘤細胞生長的抑制作用,及兩者之間的協(xié)同作用,并探討了P13K/AKT通路在人腦膠質瘤發(fā)生發(fā)展中的作用和機制,嘗試了多靶點聯(lián)合基因治療在膠質瘤中的作用。

3、
　　 本課題研究分為以下三個部分。
　　 第一部分:攜帶野生型PTEN基因的重組腺病毒(Ad-PTEN)在人胚胎腎上皮細胞HEK293中進行擴增,并用噬菌斑法測定其滴度為8×109。利用腺病毒轉染技術和Western-Blot法確定攜帶野生型PTEN基因的重組腺病毒(Ad-PTEN)轉染LN229細胞的最佳感染復數(shù)值(MOI值)為100。用四唑鹽(MTT)比色法測出LY294002在LN229中的半數(shù)抑制率(IC50)

4、為16.33μmol/L,聯(lián)合轉染Ad-PTEN后的藥物半抑制率(IC50)為8.32μmol/L,提示Ad-PTEN對LY294002有增敏效果,兩者均在臨床用藥安全范圍之內(nèi)。
　　 第二部分:側重在體外部分對人腦膠質瘤細胞系LN229進行研究,將LN229細胞分成6組:①空白對照組、②DMSO組、③空載病毒組、④Ad-PTEN組、⑤LY294002組、⑥Ad-PTEN+LY294002聯(lián)合治療組。分別用MTT法檢測細胞存活率

5、、流式細胞儀檢測細胞周期、AnnexinV-FITC法檢測細胞凋亡、Transwell法和劃痕實驗檢測細胞侵襲和遷移能力,Westernblot檢測相關蛋白的表達。結果表明:MTT顯示,與LN229對照組、DMSO組和空載病毒組比較,Ad-PTEN組、LY294002組和Ad-PTEN+LY294002聯(lián)合治療組細胞的生長在治療48h后出現(xiàn)明顯抑制,以Ad-PTEN+LY294002聯(lián)合治療組對LN229細胞增殖的抑制作用最為明顯。流式

6、細胞周期分析顯示:Ad-PTEN組、LY294002組和聯(lián)合治療組的細胞與其他三組LN229細胞相比,S期比例依次降低,細胞阻滯于G0/G1期,聯(lián)合治療組的G0/G1阻滯明顯高于其他各組。細胞凋亡檢測:Ad-PTEN組、LY294002組和聯(lián)合治療組的凋亡率較之其他三組凋亡率出現(xiàn)下降,以后者的凋亡率下降最為顯著。Transwell實驗和劃痕實驗的結果表明:Ad-PTEN組、LY294002組和聯(lián)合組治療后,LN229細胞系的侵襲和遷移細

7、胞絕對數(shù)減少,以聯(lián)合治療組下降幅度最大。Westernblot檢測發(fā)現(xiàn):Ad-PTEN組、LY294002組和聯(lián)合組分別治療LN229細胞后,P13K/AKT通路下游蛋白P13K、p-AKT、PCNA、Bcl-2、MMP-2、MMP-9及CyclinD1表達水平均有明顯的下調,其中聯(lián)合治療組中下調程度較單獨用藥顯著；而抑癌蛋白Caspase-3的表達則明顯上調,Ad-PTEN組和聯(lián)合治療組的出現(xiàn)PTEN蛋白上調,FAK蛋白下調。

8、　　 第三部分為體內(nèi)實驗,利用LN229裸鼠移植瘤皮下模型進行研究。將裸鼠隨機分為空白對照組、DMSO組、空載病毒組、轉染Ad-PTEN組、LY294002組、聯(lián)合治療組。瘤內(nèi)多點注射給藥,并繪制腫瘤生長曲線。動物處死后取出腫瘤組織,免疫組化染色。結果顯示:Ad-PTEN組、LY294002組和聯(lián)合治療組中P13K、p-AKT、MMP2、MMP9、PCNA、Bcl-2及cyclinD1蛋白表達水平明顯下調,而抑癌蛋白Caspase-3

9、的表達則明顯升高,并以聯(lián)合治療組對蛋白的影響最為顯著。Ad-PTEN組和聯(lián)合治療組的PTEN蛋白上調,FAK蛋白下調。
　　 結論：
　　 1.LY294002單獨作用于人膠質瘤細胞系LN229的IC50值為16.33μmol/l,聯(lián)合Ad-PTEN后的IC50值為8.32μmol/l,均在臨床應用的安全范圍之內(nèi),可以作為治療LN229細胞系的給藥濃度。
　　 2.在體內(nèi)、外實驗中LY294002和.Ad-PTE

10、N可以引起人膠質瘤細胞系LN229周期阻滯在G0/G1期、凋亡增加、存活率下降,侵襲和遷移的細胞數(shù)目減少。但以兩者聯(lián)合應用效果最佳,體現(xiàn)兩者具有正向協(xié)同作用。
　　 3.LY294002與Ad-PTEN兩者聯(lián)合應用所起正向協(xié)同作用與P13K/AKT下游的PCNA、CyclinD1、Bcl-2、MMP2、MMP9蛋白水平下降和caspase-3蛋白水平上升有關。并且,PTEN可以通過抑制FAK表達改變?nèi)四z質瘤細胞系LN229的生物