克氏原螯蝦致橫紋肌溶解危害物與過(guò)敏原的分析.pdf

1、2010年秋季，南京市共收治食用克氏原螯蝦(Procambarus clarkii，crayfish)致橫紋肌溶解的病例23人，國(guó)內(nèi)學(xué)者推測(cè)該疾病可能與過(guò)敏反應(yīng)或生物毒素有關(guān)，但尚未得到確認(rèn)。此外，蝦類過(guò)敏是人類常見(jiàn)的一種過(guò)敏性疾病，但目前國(guó)內(nèi)關(guān)于克氏原螯蝦過(guò)敏原的報(bào)道僅見(jiàn)其分子生物學(xué)的相關(guān)研究。因此，開(kāi)展關(guān)于克氏原螯蝦致橫紋肌溶解危害物與過(guò)敏原的分析研究具有重要的現(xiàn)實(shí)意義。
　　 蝦類過(guò)敏嚴(yán)重地影響著消費(fèi)者的健康，本研究擬純化

2、克氏原螯蝦的過(guò)敏原并分析其過(guò)敏性。本研究采用甲殼類過(guò)敏患者血清的Western-blotting確定克氏原螯蝦的主要過(guò)敏原，通過(guò)鹽析、等電點(diǎn)沉淀及熱處理等方法純化過(guò)敏原并加以鑒定；通過(guò)DNAman軟件分析過(guò)敏原的序列同源性，PeptideCutter軟件預(yù)測(cè)其酶切位點(diǎn)；完成過(guò)敏原的體外模擬胃、腸液消化，以及不同時(shí)間蒸煮處理蝦肉粗提液的模擬胃腸液二相消化，利用Western-blotting和抑制性ELISA分析其消化穩(wěn)定性及免疫活性。結(jié)

3、果顯示，克氏原螯蝦中相對(duì)分子量36 kDa的蛋白組分與13份甲殼類動(dòng)物過(guò)敏患者血清均發(fā)生特異的免疫雜交反應(yīng)，與兔抗擬穴青蟹原肌球蛋白(Tropomyosin，TM)多克隆抗體發(fā)生特異性免疫雜交反應(yīng)，且該蛋白耐熱，等電點(diǎn)約4.5，表明克氏原螯蝦的主要過(guò)敏原為TM；克氏原螯蝦TM與南美白對(duì)蝦TM、擬穴青蟹TM的氨基酸序列相似性較高(>90%)，有49個(gè)胰蛋白酶和6個(gè)胰凝乳蛋白酶的酶切位點(diǎn)(酶切幾率>70%)；TM不易被胃蛋白酶降解，易于被胰

4、蛋白酶和胰凝乳蛋白酶降解，但消化產(chǎn)物仍具有一定的免疫活性；蒸煮處理可減弱TM的消化穩(wěn)定性及消化產(chǎn)物免疫活性，且蒸煮處理時(shí)間越長(zhǎng)，效果越顯著。以上結(jié)果表明TM為克氏原螯蝦主要過(guò)敏原，與其他甲殼類動(dòng)物TM序列相似性較高，模擬胃腸液消化產(chǎn)物仍具有一定的免疫活性，蒸煮處理能減弱其消化穩(wěn)定性及免疫活性，但不能完全消除其免疫活性。
　　 克氏原螯蝦致橫紋肌溶解嚴(yán)重地威脅著消費(fèi)者的健康，但其病因至今仍未得到確認(rèn)。本研究首先采用克氏原螯蝦的肌肉

5、、鰓腸腺體(Gills，Intestines，and Glands，GIG)分別與小鼠的肌漿、肌原纖維在體外孵育；其次，用搗碎的克氏原螯蝦的肌肉、GIG灌胃ICR小鼠，觀察小鼠的癥狀，收集小鼠血清用于臨床化學(xué)分析，摘取小鼠組織用于病理學(xué)分析；最后，采用溶血實(shí)驗(yàn)和細(xì)胞毒性實(shí)驗(yàn)分析克氏原螯蝦肌肉、GIG的甲醇/水粗提物。結(jié)果顯示只有GIG鹽溶性、脂溶性粗提物可降解小鼠肌原纖維；GIG灌胃處理能使小鼠出現(xiàn)肌無(wú)力，血清(肌酸激酶及乳酸脫氫酶等)

6、和尿液的檢測(cè)指標(biāo)升高，心臟肌肉、胃、脾、骨骼肌等組織出現(xiàn)病變，其中三只小鼠患橫紋肌溶解癥，表現(xiàn)為：癱瘓、血清肌酸激酶水平是對(duì)照組的五倍或五倍以上、腎臟和骨骼肌出現(xiàn)病變，說(shuō)明GIG含有致橫紋肌溶解的危害物；小鼠的血清IgE水平較低，說(shuō)明小鼠無(wú)發(fā)生過(guò)敏反應(yīng)；GIG的甲醇/水粗提物有溶血作用和細(xì)胞毒性作用，但其作用不能被哇巴因抑制，說(shuō)明克氏原螯蝦不含有?？舅亍Ｒ陨辖Y(jié)果表明克氏原螯蝦GIG最有可能會(huì)誘發(fā)橫紋肌溶解，且具有個(gè)體差異性，與?？舅?/p>