一種微量制備型凝膠電泳裝置的研制.pdf

1、蛋白質(zhì)混合物的高效分離對蛋白質(zhì)以及蛋白質(zhì)組的定性和定量分析及應(yīng)用具有重要意義，但由于蛋白質(zhì)種類多，動態(tài)范圍寬，其分離和制備面臨巨大挑戰(zhàn)。目前，蛋白質(zhì)組學(xué)中常用的蛋白質(zhì)混合物高效分離技術(shù)主要包括高效液相色譜和電泳技術(shù)。電泳技術(shù)相較于高效液相色譜，其優(yōu)勢是分離度高，并且可以得到等電點、相對分子質(zhì)量信息，其劣勢是費時費力，自動化程度低，且難以用于蛋白質(zhì)的制備。制備電泳技術(shù)是在制備電泳裝置中對目標物質(zhì)進行分離、純化和收集制備的一種技術(shù)。在過去的

2、幾十年里，制備電泳技術(shù)和制備型電泳裝置取得了很大的進展，其制備量也從毫克級的蛋白質(zhì)逐漸減少到微克級的蛋白質(zhì)，可滿足蛋白質(zhì)組學(xué)研究需求?，F(xiàn)已商品化的制備型電泳裝置分為毫克級制備型電泳裝置和微克級制備型電泳裝置。毫克級制備型電泳裝置多為早期的裝置，其不足是樣品分離和收集的耗時很長（通常在10 h以上），回收率低，收集的過程中需不斷補充洗脫液，實驗過程較為繁瑣，且只能用于毫克級以上的蛋白質(zhì)樣品的制備；近年來，微克級制備型電泳裝置的發(fā)展較為迅速

3、，但也存在諸如實驗過程繁瑣、樣品分離度不夠高等問題。為此，我們設(shè)計制作了一套微量級制備型凝膠電泳裝置，用于實驗室的微量級快速、簡便的蛋白質(zhì)分離與制備，其制備過程為：首先將微克級的蛋白質(zhì)按照分子量大小進行分離，然后轉(zhuǎn)移凝膠至洗脫收集裝置中對蛋白質(zhì)進行洗脫收集。對此套制備型凝膠電泳裝置的性能測試結(jié)果表明，該裝置可以簡便、高效、高回收率地完成蛋白質(zhì)樣品的分離制備。
　　本論文由三章組成。第一章介紹了現(xiàn)有的分離分析技術(shù)在蛋白質(zhì)組學(xué)中的發(fā)展

4、與現(xiàn)狀，尤其是對制備型電泳方法與技術(shù)做了詳細的概述。同時，第一章還包括本研究的內(nèi)容、所要解決的具體問題以及研究意義。
　　在第二章，介紹了我們設(shè)計并制作的一套制備型凝膠電泳與紫外檢測聯(lián)用裝置。該裝置通過將改進的平板凝膠電泳裝置與外部氣體壓縮泵、高壓儲液罐、紫外檢測器、電腦以及餾分收集器相連，實現(xiàn)了在線完成蛋白樣品組分的分離、檢測與回收的目標。在對裝置的性能測試與評價實驗中，采用馬心肌紅蛋白和牛血清白蛋白作為標準蛋白混合物，考察了該

5、裝置分離性能，紫外吸收光譜結(jié)果表明成功分離了這兩個蛋白。盡管如此，在實驗中我們發(fā)現(xiàn)該裝置存在有許多問題：整個實驗過程耗時過長，裝置漏液現(xiàn)象嚴重，正極處產(chǎn)生氣泡現(xiàn)象對檢測和收集產(chǎn)生影響，而且裝置在加工中成型慢，加工周期長，這些都是我們進一步改進備型凝膠電泳設(shè)計時需要解決的問題。
　　在第三章，介紹了在制備型凝膠電泳與紫外檢測聯(lián)用裝置基礎(chǔ)上的一種新型制備型凝膠電泳裝置。為了解決制備型凝膠電泳與紫外檢測聯(lián)用裝置存在的諸多問題，我們將裝置

6、由在線檢測改為了離線檢測，并基于3D打印技術(shù)和數(shù)字控制加工技術(shù)，設(shè)計了制作簡單，成型快，周期短，精度高的制備型凝膠電泳分離-洗脫聯(lián)用裝置。按照蛋白質(zhì)分離與洗脫方向的不同，可分為橫向洗脫和垂直洗脫制備型凝膠電泳分離-洗脫聯(lián)用兩種裝置。通過對設(shè)計制作的制備型凝膠電泳分離-洗脫聯(lián)用裝置的機械強度、防漏液與操作性能測試，對符合要求的裝置進一步進行了蛋白樣本分離、洗脫回收、分離度、回收率、洗脫時間以及洗脫樣本的液相色譜-質(zhì)譜分析等測試。在優(yōu)化設(shè)計

7、和性能測試的基礎(chǔ)上，確定定型的制備型凝膠電泳裝置為垂直洗脫的制備型凝膠電泳分離-洗脫聯(lián)用裝置。蛋白混合物分離實驗結(jié)果表明制備型凝膠電泳分離裝置不僅能夠?qū)Φ鞍踪|(zhì)樣本進行高效分離，而且具有高的重復(fù)性；在采用制備型凝膠電泳洗脫裝置進行的洗脫實驗中，由于蛋白樣本垂直于凝膠厚度方向洗脫，因此，在最佳洗脫條件下，洗脫時間少于20分鐘，碳酸酐酶的回收率高達91.8％，實現(xiàn)了快速、高回收率的洗脫，優(yōu)于同類型的商品化的制備型凝膠電泳裝置。將垂直洗脫的制備

8、型凝膠電泳分離-洗脫聯(lián)用裝置用于標準蛋白混合物以及酵母全蛋白的分離與制備，其分離度和分離效率均優(yōu)于商品化的制備型凝膠電泳裝置。將該裝置作為預(yù)分離手段，與液相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用，對10μg的牛血清白蛋白進行分離、洗脫后進行FASP（ filter aided proteome preparation）酶解與經(jīng)過該分離裝置分離后進行膠內(nèi)酶解做了對比，結(jié)果表明，經(jīng)該裝置分離、洗脫和FASP酶解的方法最多鑒定到94個特異性肽段，平均蛋白質(zhì)序列覆蓋率

9、為90.12%；經(jīng)該分離裝置分離后進行膠內(nèi)酶解，最多鑒定到70個特異性肽段，平均蛋白質(zhì)序列覆蓋率為86%。同樣地，我們對20μg的酵母蛋白提取物也做了上述對比實驗，結(jié)果表明，相同條件下使用該裝置分離、洗脫和FASP酶解的方法鑒定到的肽段數(shù)目、序列覆蓋率大于50%的蛋白數(shù)目以及打分值大于1000的蛋白數(shù)目均遠遠多于利用該裝置分離后進行膠內(nèi)酶解所鑒定到的相應(yīng)的肽段數(shù)目和蛋白數(shù)目。以上實驗說明使用該裝置進行分離、洗脫后進行FASP酶解的方法更