新型光學(xué)核酸探針的制備及其在生化分析中的應(yīng)用研究.pdf

1、在生化分析研究中，核心是檢測探針的設(shè)計與制備。光學(xué)核酸探針具有設(shè)計靈活、信號獲取方便、檢測靶標廣泛、以及檢測策略豐富等優(yōu)良特性，吸引了研究者們的高度興趣，已經(jīng)成為分析研究工作中的重要工具。從光學(xué)核酸探針的結(jié)構(gòu)組成來看，信號單元的設(shè)計是最靈活、研究內(nèi)容最豐富的部分，因此，合理設(shè)計與構(gòu)建信號單元一直是核酸探針發(fā)展的基礎(chǔ);其次，從光學(xué)核酸探針的發(fā)展歷程和趨勢來看，隨著科技的進步，人們對分析研究工作的要求不斷上升，提高分析檢測方法的靈敏度一直是

2、研究者們追求的目標之一;同時，構(gòu)建通用性、多功能檢測探針，實現(xiàn)多靶標檢測也是核酸探針發(fā)展的一大趨勢。因此，本論文著眼于以信號單元的構(gòu)建為基礎(chǔ)、以信號放大技術(shù)的發(fā)展和多靶標響應(yīng)探針的設(shè)計為目標，制備可以應(yīng)用于生化分析的新型光學(xué)核酸探針。主要開展了以下研究工作:
　　一、Poly(T)穩(wěn)定的熒光銅納米顆粒的合成及其熒光性質(zhì)研究近年來，熒光金屬納米材料作為一類新型的納米信號單元在分析領(lǐng)域得到廣泛的研究和應(yīng)用。在本工作中，我們以發(fā)展一種合

3、成熒光銅納米顆粒(CuNPs)的新方法為目的，以生物分子單鏈DNA(ssDNA)作為模板穩(wěn)定劑去合成熒光CuNPs，系統(tǒng)地篩選了能夠作為模板分子去穩(wěn)定合成熒光CuNPs的ssDNA。我們發(fā)現(xiàn)，在含有還原劑抗壞血酸鈉的MOPS緩沖液中，聚胸腺嘧啶寡核苷酸(poly(T》能夠有效地穩(wěn)定熒光CuNPs的合成，而聚腺嘌呤寡核苷酸(poly(A))、聚胞嘧啶寡核苷酸(poly(C))、聚鳥嘌呤寡核苷酸(poly(G))、以及隨機的ssDNA序列不

4、能有效地穩(wěn)定該熒光納米材料的合成。該熒光CuNPs合成快速，具有大的斯托克斯位移(Stokes shifting)，其熒光強度對poly(T)聚合程度、poly(T)長度、poly(T)濃度、以及銅離子濃度具有正相關(guān)性質(zhì)，較低的環(huán)境溫度、弱堿性緩沖液、以及適中的緩沖液離子強度有利于poly(T)穩(wěn)定的熒光銅納米顆粒的合成。因此，該發(fā)現(xiàn)為生化傳感提供了一種新的納米信號單元，同時，基于該CuNPs對ssDNA的序列依賴性，為ssDNA分子上

5、的位點選擇性礦化提供了新的材料和方法。
　　二、基于poly(T)穩(wěn)定的熒光銅納米顆粒和功能化的“水凝膠試紙”對銅離子的可視化便捷式檢測研究由于poly(T)穩(wěn)定的熒光CuNPs的信號對銅離子濃度具有高度依賴性，我們立足于發(fā)展一種可視化和便捷式的銅離子檢測方法。為了實現(xiàn)這個目的，我們設(shè)計了一種功能化的“水凝膠試紙”，poly(T)作為檢測探針與抗壞血酸鈉被包埋在水凝膠內(nèi)部，凝膠表面設(shè)計有進樣微孔，通過移液槍將樣品滴加在微孔中，在紫

6、外燈照射下觀察和記錄檢測結(jié)果。該方法對銅離子的檢測具有很好的選擇性、檢測下限達到20μM。同時，該方法是一種“add-and-read”的模式，操作極其簡單方便;使用試劑廉價，不需要對信號單元進行復(fù)雜的合成，也不需要對核酸探針進行繁瑣的標記;基于微陣列功能化“水凝膠試紙”，可實現(xiàn)高通量檢測信號的獲取;“水凝膠試紙”具有較好的時間穩(wěn)定性和功能恢復(fù)性，對其內(nèi)部包裹的探針具有很好的抗環(huán)境干擾保護作用。該方法不僅會促進銅離子的大眾化檢測應(yīng)用，而

7、且這種基于“水凝膠試紙”的傳感理念也將適用于其他目標物質(zhì)的檢測。
　　三、基于poly(T)穩(wěn)定的熒光銅納米顆粒對核酸酶免標記高靈敏檢測及其抑制劑篩選研究由于poly(T)穩(wěn)定的熒光CuNPs的信號對poly(T)長度的高度依賴性，我們以poly(T)為檢測探針，其穩(wěn)定合成的熒光CuNPs作為信號單元，發(fā)展了一種超靈敏的核酸酶檢測方法。Poly(T)被核酸酶處理之后，降解成單個的核苷酸或者短的寡核苷酸片段，不具備穩(wěn)定合成熒光CuN

8、Ps的能力，熒光信號消失。該方法在操作上簡單快捷，不需要對檢測探針做任何修飾或標記;原位合成的熒光銅納米顆粒信號產(chǎn)生快，檢測時間短。以S1核酸酶為模式靶標，實現(xiàn)了極低的檢測下限和良好的線性范圍，最低可檢測濃度為5×10-7 unitsμL-1，相對于其他酶類和蛋白質(zhì)，具有很好的選擇性。同時，該方法具備對核酸酶抑制劑篩選的能力。
　　四、基于dsDNA穩(wěn)定的熒光銅納米顆粒和聚合酶鏈式反應(yīng)對核酸的放大檢測研究在本工作中，我們將雙鏈DN

9、A(dsDNA)穩(wěn)定合成的熒光CuNPs發(fā)展成一種“綠色”納米染料，用于PCR放大產(chǎn)物的信號獲取、以及靶標核酸分子的放大檢測。當有靶標DNA分子存在的時候，經(jīng)過PCR放大后產(chǎn)生大量的dsDNA，可穩(wěn)定熒光CuNPs的合成，在紫外光激發(fā)下，可以檢測到熒光信號。該核酸放大檢測方法具有信號響應(yīng)快、成本低廉的特點;相對于傳統(tǒng)有機嵌入染料而言，熒光CuNPs具有低毒環(huán)保的優(yōu)勢;相對于染料標記的核酸探針而言，熒光CuNPs具有操作簡單、免標記的優(yōu)勢

10、。
　　五、基于靶標催化的核酸動態(tài)自組裝和芘二聚體熒光開關(guān)效應(yīng)對核酸的免酶恒溫放大檢測研究在核酸分子的放大檢測中，除了PCR等酶促循環(huán)放大技術(shù)之外，發(fā)展恒溫、甚至免酶的核酸放大技術(shù)是目前分析化學(xué)研究中的一大熱點。我們設(shè)計了三個亞穩(wěn)態(tài)的發(fā)夾探針作為自組裝原料，每個探針的5'端具有12個核苷酸長度的粘性末端，每個探針的5'和3'端都標記有空間敏感性染料分子芘(pyrene)。當引入靶標核酸分子的時候，靶標分子會催化探針之間發(fā)生鏈置換反

11、應(yīng)，組裝成Y字型結(jié)構(gòu)，該結(jié)構(gòu)的末端為平齊末端，使得相鄰探針上的芘分子靠近產(chǎn)生excimer熒光信號。每一輪組裝產(chǎn)生1個字型核酸結(jié)構(gòu)、3個excimer，并且可以將靶標分子置換下來用于下一輪催化組裝，從而實現(xiàn)信號的循環(huán)放大。該方法具有較好的特異性和靈敏度，對模式DNA分子的檢測下限可以達到10pM。相對于PCR等酶促循環(huán)放大技術(shù)，該放大方法不需要酶蛋白的參與、不依賴于高精度的熱循環(huán)裝置、操作簡單。
　　六、基于雙響應(yīng)單分子熒光核酸探

12、針的設(shè)計對汞離子和銀離子的多靶標檢測研究除了放大技術(shù)的發(fā)展，多功能核酸探針的設(shè)計也是核酸探針研究與應(yīng)用中的一大熱點。我們設(shè)計了一種能夠?qū)x子和銀離子具有雙響應(yīng)的單分子多功能核酸探針(unimolecular multifunctional DNA probe，UMDP)，并將其用于汞離子和銀離子的多靶標檢測。當檢測體系中有靶標離子的時候，UMDP被誘導(dǎo)從單鏈轉(zhuǎn)換成發(fā)夾構(gòu)型。兩端標記的熒光基團FAM和淬滅基團DABCYL靠近，熒光熄滅。

13、該探針對靶標離子的檢測具有很好的選擇性，對Hg2+和Ag+的檢測下限分別為0.67nM和0.95nM。同時，通過富C鏈(C-rich DNA)對熄滅后的熒光信號的恢復(fù)情況，我們可以實現(xiàn)對兩種靶標離子的區(qū)分。
　　七、基于雙響應(yīng)單分子核酸探針和免修飾的金納米顆粒對汞離子和銀離子的多靶標比色法檢測研究為了使信號獲取更加方便快捷，我們基于UMDP和免修飾的金納米顆粒、針對汞離子和銀離子構(gòu)建了一種多靶標比色檢測方法。在沒有靶標離子存在的時

14、候，探針為自由單鏈狀態(tài)，能夠很好的吸附在金納米顆粒表面，提高其膠體穩(wěn)定性，使得金納米顆粒在較高的鹽濃度下能夠分散存在，顏色為酒紅色;當存在靶標離子的時候，靶標離子誘導(dǎo)探針形成發(fā)夾構(gòu)型，由于雙鏈和發(fā)夾DNA對金納米顆粒的穩(wěn)定作用較差，使得金納米顆粒在較高的鹽濃度下發(fā)生團聚，顏色變?yōu)樗{色，同時伴隨著吸收光譜的紅移。該多靶標檢測方法，對靶標離子有很好的選擇性，對Hg2+和Ag+的檢測下限分別為250nM和500nM。同時，我們利用EDTA對兩