Genome shuffling提高埃博霉素B的發(fā)酵產(chǎn)量.pdf

1、埃博霉素B(EpothiloneB)是粘細(xì)菌纖維堆囊菌(Sorangiumcellulosum)產(chǎn)生的一種具有抗腫瘤活性的十六元大環(huán)內(nèi)酯類化合物。目前百時(shí)美施貴寶公司的一個(gè)埃博霉素藥物（依沙匹隆）已經(jīng)由美國(guó)FDA批準(zhǔn)上市，其它一些埃博霉素藥物已經(jīng)進(jìn)入了不同階段的臨床評(píng)估，如EpothiloneD(KOS-862)、Patupilone(epothiloneB,EPO906)、ZK-EPO、BMS-310705、KOS-1584和ABJ8

2、79，并取得了良好的效果，有望在近年內(nèi)獲準(zhǔn)上市。埃博霉素的巨大應(yīng)用價(jià)值已勿容置疑，但目前埃博霉素的發(fā)酵產(chǎn)量還很不理想，如何提高生產(chǎn)菌的埃博霉素產(chǎn)生能力仍是目前該藥物研發(fā)的一個(gè)熱點(diǎn)問題。
　　 Genomeshuffling育種技術(shù)是DNAshuffling技術(shù)在全基因組水平上的拓展，它采用遞歸原生質(zhì)體融合的方法模擬DNAshuffling技術(shù)中的PCR熱循環(huán)。Genomeshuffling育種技術(shù)包括三個(gè)步驟，首先需要獲得遺傳多

3、樣性菌株;然后利用遞歸原生質(zhì)體融合手段使遺傳背景多樣性菌株之間發(fā)生廣泛的基因重組，獲得大量突變菌株;最后篩選出高產(chǎn)目標(biāo)產(chǎn)物突變菌株。
　　 本論文主要取得了如下研究結(jié)果:
　　 1、為了獲得基因組特征更多樣的埃博霉素B產(chǎn)生菌株，首先從不同生境中分離篩選到4株能產(chǎn)生埃博霉素B的纖維堆囊菌，以這些野生菌株作為Genomeshuffling遞歸原生質(zhì)體融合出發(fā)菌株，又經(jīng)過五輪遞歸融合成功選育到了3株遺傳穩(wěn)定的高產(chǎn)埃博霉素B突變

4、菌株，其中一株突變菌株SoF5-07的埃博霉素B產(chǎn)量達(dá)到了8.7mg/L，比原始出發(fā)菌株So07-9埃博霉素B產(chǎn)量提高了19.3倍。研究結(jié)果顯示用野生菌株作為Genomeshuffling遞歸原生質(zhì)體融合出發(fā)菌株也能有效提高目標(biāo)代謝產(chǎn)物的產(chǎn)量。
　　 2、為了加強(qiáng)Genomeshuffling育種過程中對(duì)菌株的誘變頻率，從而獲得遺傳多樣性更加豐富的突變子庫。本論文對(duì)Genomeshuffling技術(shù)進(jìn)行了改良，具體措施是在遞歸原

5、生質(zhì)體融合過程中對(duì)原生質(zhì)體進(jìn)行了紫外誘變。以菌株SoF5-07為出發(fā)菌株，首先通過UV和DES復(fù)合誘變方法獲得了四株突變菌株，再通過三輪改良后Genomeshuffling育種技術(shù)成功選育到了2株遺傳穩(wěn)定的高產(chǎn)埃博霉素B重組菌株，其中一株重組菌株So073-45的埃博霉素B產(chǎn)量比出發(fā)菌株SoF5-07提高了81.6％，達(dá)到了15.8mg/L。而用常規(guī)Genomeshuffling育種流程獲得的產(chǎn)量最高菌株的產(chǎn)量為13.5mg/L，這說明

6、了改良后的Genomeshuffling也可以有效提高埃博霉素B的產(chǎn)量，而且比傳統(tǒng)的Genomeshuffling育種效率稍高。
　　 3、優(yōu)化了改良Genomeshuffling篩選出的高產(chǎn)菌株So073-45的發(fā)酵工藝。通過單因素和正交試驗(yàn)研究了埃博霉素B合成的最佳培養(yǎng)基。獲得的埃博霉素B最適發(fā)酵培養(yǎng)基為糊精0.3％，蔗糖0.07％，葡萄糖0.02％，豆餅粉0.17％，MgSO4·7H2O0.1％，無水氯化鈣0.1％，EDT