埃博霉素A、B的微生物轉化及產物抑瘤效果研究.pdf

1、埃博霉素，作為一種16元環(huán)的大環(huán)內酯抗生素，其抗癌活性已經被認可。目前，已經發(fā)現的埃博霉素及其衍生物水溶性并不可觀，同時該類藥物具有較嚴重的神經毒性等副作用。一直以來，這些問題嚴重制約了埃博霉素類藥物在臨床上的應用。為了應對這個問題，本課題將利用微生物轉化的方法尋找新的埃博霉素類似物。微生物轉化是對天然化合物進行結構改造的一種新興技術，這種方法能夠發(fā)現更多的天然化合物的新型衍生物。本課題是利用土壤中的多種微生物分別對埃博霉素進行轉化實驗

2、，以尋找具有轉化作用的菌株并鑒定轉化后的產物。研究內容主要分為四個方面。
　　首先是埃博霉素A、B的制備，本課題利用固體發(fā)酵技術對纖維堆囊菌進行培養(yǎng)，利用大孔吸附性樹脂對纖維堆囊菌的代謝產物—埃博霉素進行富集，然后使用色譜級甲醇對樹脂中的埃博霉素進行解吸附。再利用四氯化碳對埃博霉素進行萃取純化。利用這種方法得到的埃博霉素的總純度達95％，相比于傳統(tǒng)的埃博霉素液體發(fā)酵法產物萃取純度提高了40%左右。
　　第二是轉化菌種的篩選，

3、本課題中用于轉化實驗的菌株均來自于土壤。采集不同環(huán)境下的土壤樣品，進行微生物的分離純化，建立菌種庫，將菌種庫中所有菌種均進行埃博霉素的轉化實驗，根據高效液相色譜檢測，篩選出具有轉化作用的菌種，并進行菌種鑒定。在此設計方案下，本課題共采集23種不同環(huán)境下的土壤樣品，并分離純化得到262株菌，其中真菌112株，細菌150株。最終篩選到具有轉化作用的菌種有5株，其中1株真菌，4株細菌。對篩選到的菌種進行分子學鑒定，這五種菌分別是伯克氏菌，巨大

4、芽孢桿菌，多粘類芽孢桿菌，克雷伯氏菌，以及煙曲霉菌。根據高效液相色譜儀檢測，共得到5種轉化產物，其中伯克氏菌能夠將埃博霉素（A&B）轉化成兩種產物—產物1和產物2；巨大芽孢桿菌能夠將埃博霉素 B轉化為產物2；多粘類芽孢桿菌和克雷伯氏菌具有相同的轉化作用，將埃博霉素（A&B）轉化為兩種產物—產物3和產物4；煙曲霉能夠將埃博霉素A轉化成產物5。
　　接下來本文選取伯克氏菌的轉化產物進行制備并做出結構鑒定。首先將伯克氏菌的轉化發(fā)酵進行放

5、大處理，得到大量的轉化產物，之后利用大孔樹脂的吸附作用進行富集，再利用色譜級甲醇浸泡樹脂進行解吸附，最后利用制備液相色譜對轉化產物進行分離和純化。對兩種產物和埃博霉素A&B分別進行質譜分析，二級質譜分析以及1H-NMR譜，13C-NMR譜分析，綜合所有譜圖進行對比分析，最終對產物1和產物2的結構做出最終確認：產物1是由埃博霉素B轉化而來，其
　　分子結構是在埃博霉素B的C12-C13位的環(huán)氧環(huán)發(fā)生開環(huán)反應，兩個C上均連接一個羥基。

6、產物2是由埃博霉素A轉化而得，其分子結構是埃博霉素A的C1位和C12至C15片段發(fā)生大環(huán)內酯的重排反應，原本C1-O-C15的酯鍵斷裂，C15-O-與C12位相連，C12-C13處的環(huán)氧環(huán)開環(huán)，C13-O-與C1位相連。
　　最后對兩種轉化產物進行抑瘤效果分析。本課題選用人宮頸癌細胞—Hela細胞研究埃博霉素轉化產物體外活性。通過MTT實驗最終得到產物1的半數抑制率（IC50）為15.6 ng/mL，細胞抑制率為75.4%；產物2