α-氨基腈類腈水合酶酶源的篩選及其在合成2-氨基-2,3-二甲基丁酰胺中的應用.pdf

1、微生物腈水合酶作為腈轉化酶家族的重要一員，能夠催化腈類化合物的水合反應生成高附加值的酰胺，被廣泛應用于制備醫(yī)藥、農藥中間體和精細化工產品等。2-氨基-2，3-二甲基丁酰胺是廣譜、高效的咪唑啉酮除草劑合成的關鍵中間體。腈水合酶催化轉化2-氨基-2，3-二甲基丁腈制備2-氨基-2，3-二甲基丁酰胺具有產率高、反應條件溫和、環(huán)境友好等特點，符合“綠色化學”的要求。本論文以該工藝路線為核心，從生物催化劑的發(fā)現、表征、制備與應用，產物的分離、提純

2、等方面展開研究。
　　 本文首先創(chuàng)建了一個以α-氨基腈或α-氨基酰胺為底物的腈水合酶和酰胺酶高通量篩選模型。研究并提出了其顯色反應的機理，是基于亞鐵離子和鐵離子與α-氨基腈溶液中的氰離子或α-氨基酰胺溶液中的氫氧根離子的反應。通過該模型，從418株菌種中篩選到了3株能轉化2-氨基-2，3-二甲基丁腈生產2-氨基-2，3-二甲基丁酰胺的腈水合酶產生菌。其中兩株篩選自土壤樣品，編號ZA0707和P4；另外一株菌Rhodococcus

3、 boritolerans CCTCC M208108來自本實驗室的微生物菌庫。該模型是第一個直接、快速的腈水合酶高通量篩選模型，同時也是第一個集腈水合酶和酰胺酶的篩選于一體的篩選模型。
　　 通過形態(tài)學、生理生化試驗、API自動鑒定系統(tǒng)、16S rDNA序列及系統(tǒng)發(fā)育分析，菌株ZA0707被鑒定為慶笙紅球菌(Rhodococcusqingshengii)。這是該種內首次報道的產腈水合酶的菌株。進而研究并對比了菌株ZA0707和

4、R.boritolerans CCTCC M208108胞內腈水合酶的氰離子耐受性、產物耐受性、熱穩(wěn)定性和對2-氨基2，3-二甲基丁腈活力等方面的特性，優(yōu)選R.boritolerans CCTCC M208108作為酶法轉化2-氨基2，3-二甲基丁腈制備2-氨基2，3-二甲基丁酰胺的生物催化劑并用于后續(xù)實驗。
　　 通過單因素和響應面優(yōu)化法對R.boritolerans CCTCC M208108產腈水合酶的培養(yǎng)基成分進行了優(yōu)化

5、。確定了較佳的產酶培養(yǎng)基組分為(g/l)：蔗糖7.00，檸檬酸鈉3.04，牛肉膏5.13，酵母粉5.00，己內酰胺1.50，KH2PO41.0，K2HPO41.0，NaCl1.0，FeCl30.005，CoCl20.005，MnSO40.005。隨后研究并選定了較適宜的培養(yǎng)條件為：初始pH6.5，30℃，裝液量40 ml/250 ml，接種量1.5 ml。在上述培養(yǎng)條件下培養(yǎng)60 h后，生物量達到6.21g/l，腈水合酶的活力達到539

6、3 U/g CDW。
　　 論文還研究了酶催化反應的環(huán)境和介質對該腈水合酶活力的影響。結果表明，最適宜的緩沖液體系是Tris-HCl溶液，pH8.9；最高酶活出現在30-35℃范圍內；向反應體系中添加30％(v/v)正己烷和1mM Ni2+，酶活力可分別提高30％和23％。對酶促反應動力學參數的研究發(fā)現，反應的Vmax和Km分別為：15.73μmol·min-1·mg-1和44.30 mM。發(fā)現了降低溫度可以使2-氨基-2，3-

7、二甲基丁腈溶液更加穩(wěn)定，特別是在10℃，由底物自發(fā)解離產生的氰離子濃度僅為2.01 mM，不足30℃下的四分之一。在深入了解影響反應的主要因素以后，放大反應體系至800 ml，建立了水相和以正己烷為共溶劑的兩相反應體系；對關鍵的反應參數優(yōu)化后，有效地減輕了氰離子和底物對腈水合酶的抑制，使得產物濃度、產率和催化劑生產力分別達到50g/l、91％和6.3 gproduct/g catalyst。在優(yōu)化條件下，菌體至少可以重復利用兩次，使得催

8、化劑生產力進一步提高到12.3 g product/g catalyst。
　　 論文隨后選用膨脹型珍珠巖作為固定化的載體，采用吸附培養(yǎng)法固定R.boritolerans CCTCC M208108細胞，以提高細胞的氰離子耐受性和重復使用性能。從提高酶活的角度，優(yōu)化珍珠巖吸附固定化細胞的制備條件，確定較佳條件為：初始培養(yǎng)pH值7.0，固定化培養(yǎng)溫度30℃，載體用量40 ml(培養(yǎng)基用量40 ml，250 ml三角瓶)，最佳培養(yǎng)時

9、間54 h。在此條件下，固定化細胞和游離細胞相比氰離子耐受性和重復使用次數分別提高了16％和3批次。這是有關珍珠巖用于固定化腈水合酶或其產生菌的首次報道。研究了固定化細胞轉化2-氨基-2，3-二甲基丁腈的動力學參數：Vmax-固=13.59μmol·min-1·mg-1，Km-固=47.98 mM；并求得固定化細胞催化反應的達姆科勒數，Da=4.9×104。固定化細胞的Km-固值大于游離細胞的Km值，而且Da遠大于1，說明外部傳質阻力(

10、底物從主體溶液到固定化載體上的細胞表面所受的阻力)影響了固定化細胞轉化2-氨基-2，3-二甲基丁腈，并且可能成為反應的限速因素。
　　 論文最后開發(fā)了一個從反應體系中分離、純化產物2-氨基-2，3-二甲基丁酰胺的新方法。利用離心、活性炭吸附除雜、減壓蒸餾、乙酸乙酯/正己烷重結晶等分離手段對酶催化反應體系中的重結晶產物進行了有效分離、提純(純度達98.5％)。并通過FT-IR、1H NMR和13C NMR等分析方法對產物結構進行了