多功能納米磁性粒子的合成及其在細(xì)胞富集和質(zhì)粒DNA純化中的應(yīng)用研究.pdf

1、質(zhì)粒DNA(plasmid DNA)是基因工程的重要載體，從細(xì)胞內(nèi)提取質(zhì)粒已成為實(shí)驗(yàn)室中經(jīng)常性的基礎(chǔ)工作，構(gòu)建快捷、簡(jiǎn)單、經(jīng)濟(jì)、易于自動(dòng)化和環(huán)境友好型的供體細(xì)胞富集和質(zhì)粒DNA純化方法具有重大意義。建立在磁性固相載體基礎(chǔ)上的純化方法可使細(xì)胞或DNA直接從液體粗原料中釣出，免去了離心、沉淀等紛繁復(fù)雜的中間步驟，因而自二十世紀(jì)90年代以來得到重大發(fā)展，但已報(bào)道的磁性載體對(duì)核酸的純化能力普遍偏低，使其應(yīng)用受到限制。對(duì)于細(xì)胞富集，免疫磁性分離法

2、雖行之有效但卻受制于樣品制備、生產(chǎn)成本和儲(chǔ)藏壽命，不適于批量菌體分離，而基于非特異性吸附反應(yīng)富集細(xì)胞的磁性分離手段卻鮮見文獻(xiàn)報(bào)道。同時(shí)，已報(bào)道的磁性分離法從大腸桿菌中提取質(zhì)粒DNA時(shí)仍需兩次以上離心操作：一次是從液體培養(yǎng)基中回收細(xì)胞，另一次是去除變性的基因組DNA/蛋白質(zhì)復(fù)合體。而離心是個(gè)耗時(shí)、勞動(dòng)密集型操作，對(duì)生物大分子的剪切力較大，離心介入后不易實(shí)現(xiàn)高通量樣品分析的自動(dòng)化、微型化和集成化。
　　 針對(duì)以上問題，本研究提出了制

3、備高吸附容量、pH敏感型、多功能羧基功能化磁性納米粒子（carboxyl-functionalizedmagneticnanoparticles，CMNPs）的技術(shù)；利用其構(gòu)建集細(xì)胞捕獲、變性基因組DNA/蛋白質(zhì)復(fù)合體去除和質(zhì)粒DNA捕獲于一體的技術(shù)路線；提出基于共絮凝行為富集微生物和核酸的思路；建立無RNase介入分離質(zhì)粒DNA的方法，主要工作及結(jié)果如下：
　　 1.以FeCl3，F(xiàn)eS04，NaOH為原料，采用化學(xué)共沉法制備

4、了Fe304磁性納米粒子。分別以Bis[2-(methacryloyloxy)ethyl]phosphate為偶聯(lián)劑、甲基丙烯酸為功能單體、過硫酸鉀為引發(fā)劑，控制反應(yīng)溫度，通過超聲輻照原位聚合技術(shù)制備了羧基功能化磁性納米粒子。結(jié)果表明超聲空化作用下鐵氧體可以成為聚合反應(yīng)的活性中心，超聲功率越大則產(chǎn)物的粒徑越小，在400、600和800W超聲功率下產(chǎn)物的平均粒徑分別為96.87、55.97和49.61nm；TEM和XRD表明產(chǎn)物為尖晶石鐵

5、氧體，粒徑約7nm；FTIR分析證明聚甲基丙烯酸對(duì)鐵氧體納米粒子的成功包覆；TGA-DTG分析表明包覆層含量為7～12％；VSM測(cè)試表明包覆后飽和磁化強(qiáng)度為47emu/g，具有較強(qiáng)磁響應(yīng)性；對(duì)pH敏感，在中性環(huán)境中5min內(nèi)可悉數(shù)回收，而在酸性條件下達(dá)到相同的回收率則小于30S。
　　 2.以“捕獲率”和捕獲后“菌體/CMNPs復(fù)合體在管壁上吸附的牢固程度”為指標(biāo)，對(duì)有潛力使CMNPs與大腸桿菌結(jié)合的20種化學(xué)試劑進(jìn)行了篩選鑒定

6、，發(fā)現(xiàn)酸、鈣鹽和鋅鹽是有效的“偶聯(lián)劑”。對(duì)表現(xiàn)最好的鹽酸和氯化鈣輔助CMNPs捕獲大腸桿菌的條件進(jìn)行了優(yōu)化。結(jié)果表明，大腸桿菌的捕獲效率隨pH降低而急劇升高，在pH5左右達(dá)到較平穩(wěn)的值。細(xì)胞濃度越高，CMNPs用量越多，磁分離時(shí)間越長(zhǎng)，則相同條件下捕獲率也越高。在較優(yōu)的條件組合下（細(xì)胞OD600大于0.2，粒子用量為0.85mg，磁分離時(shí)間3min，pH值3.5～1.5）可以捕獲90％以上的大腸桿菌。以氯化鈣作為“結(jié)合液”時(shí)，鈣離子與菌

7、體濃度的比值決定了大腸桿菌的捕獲效率，二者之間關(guān)系可用Logistic模型函數(shù)擬合，并受CMNPs用量和磁分離時(shí)間的影響。在捕獲行為中，鈣離子可能起到離子橋作用，通過與納米粒子的羧基和菌體表面的活性基團(tuán)發(fā)生配位，形成菌體/CMNPs復(fù)合體。
　　 3.以CMNPs為固相載體，基于SPRI(solidphasereversibleimmobilization，SPRI)法對(duì)大腸桿菌粗裂解液中的質(zhì)粒DNA進(jìn)行了純化研究。結(jié)果表明：質(zhì)

8、粒DNA回收量與結(jié)合液濃度之間存在臨界關(guān)系，當(dāng)PEG8000＞0.15g/mL，NaCl濃度＞0.5mol/L時(shí)才能獲得穩(wěn)定的質(zhì)粒DNA收率。質(zhì)粒DNA回收量隨著CMNPs用量的增加而增加，超過最佳值后因不可逆吸附或妨礙洗脫收率反而下降。質(zhì)粒DNA在納米粒子表面的吸附與解吸附是快速過程，所需平衡時(shí)間分別為150s和40s。0～70℃之間，溫度升高對(duì)質(zhì)粒DNA在CMNPs表面吸附影響不大而RNA吸附量急劇下降。利用溫度“調(diào)諧”差示吸附DN

9、A和RNA的現(xiàn)象，建立了不需要RNase預(yù)處理而提取較純質(zhì)粒DNA的方法。
　　 4.建立了基于CMNPs快速、小量制備質(zhì)粒DNA的方案。該法整合大腸桿菌捕獲、裂解液去雜和質(zhì)粒DNA富集于一體，操作簡(jiǎn)單，無需離心，對(duì)儀器的依賴性較低且不涉及有毒試劑；質(zhì)粒DNA質(zhì)量高，主要以超螺旋構(gòu)象存在，A260/A280比值大于1.75，可滿足酶切等一般的分子生物學(xué)實(shí)驗(yàn)要求。產(chǎn)量和質(zhì)量同QIAGEN公司的標(biāo)準(zhǔn)提取試劑盒法相當(dāng)?shù)杀局挥衅?/5

10、，整個(gè)過程用時(shí)不到20min，短于試劑盒法和醇沉淀法。本法特別適用于高通量、自動(dòng)化、微型化和集成化樣品提取和分析平臺(tái)的構(gòu)建。
　　 5.現(xiàn)已報(bào)道的磁性載體核酸分離方法，對(duì)常規(guī)鹽離子含量較低(折合NaCl濃度＜0.5mol/L)的樣品（如PCR產(chǎn)物），要么用到高濃度高離液序列鹽(chaotropic)創(chuàng)造吸附或洗脫條件，對(duì)核酸具有損傷作用并造成體積放大；要么用高系黏度結(jié)合液，降低了磁性粒子的可控性，且生產(chǎn)成本高、環(huán)境不友好。針對(duì)以

11、上問題，本研究提出了以生物相容性極強(qiáng)的精胺和亞精胺作為CMNPs/核酸“結(jié)合液”，以脫鹽質(zhì)粒DNA/RNA為核酸供體，構(gòu)建了一種新的核酸富集方法。結(jié)果表明：精胺和亞精胺作為結(jié)合液時(shí)，CMNPs對(duì)質(zhì)粒DNA和RNA選擇吸附性不顯著。以亞精胺為結(jié)合液時(shí)，質(zhì)粒DNA在1～2mmol/L亞精胺濃度內(nèi)在CMNPs表面吸附；而RNA在0.5～5.5mmol/L之間具有普遍的吸附能力，但最大吸附同樣在1～2mmol/L濃度范圍。以精胺為“結(jié)合液”，C

12、MNPs對(duì)質(zhì)粒DNA的吸附率在1～7mmol/L濃度內(nèi)達(dá)100％；而對(duì)RNA吸附率在1.5～5mmol/L濃度之間接近90％，約10％小分子RNA不能被吸附。延長(zhǎng)時(shí)間可提高核酸的回收率，孵育5min之內(nèi)可達(dá)到100％吸附。凝聚試劑被充分剔除后核酸的解吸附率可達(dá)100％。精胺輔助CMNPs富集核酸的能力遠(yuǎn)強(qiáng)于亞精胺，以其作為結(jié)合液時(shí)CMNPs對(duì)核酸飽和吸附量可達(dá)2μg核酸/μg載體。
　　 6.對(duì)于低鹽濃度核酸溶液，降低pH也可驅(qū)