l-阿拉伯糖異構(gòu)酶的克隆表達和酶學(xué)性質(zhì)研究.pdf

1、D-塔格糖是一種在自然界存在極少的功能性己酮糖，可以應(yīng)用于食品、醫(yī)藥、保健及化妝品等多種領(lǐng)域。本文研究利用微生物酶生物轉(zhuǎn)化D-半乳糖為D-塔格糖，為實現(xiàn)從廉價糖原料到稀少糖的轉(zhuǎn)化奠定基礎(chǔ)。
　　 1.菌種篩選:實驗從土壤中分離出一種可產(chǎn)生L-阿拉伯糖異構(gòu)酶轉(zhuǎn)化D-半乳糖生產(chǎn)D-塔格糖的嗜熱菌株No.6。經(jīng)菌體及菌落形態(tài)、生理生化特性以及16S rDNA進化樹分析等方法，將其鑒定為Anoxybacillus flavithermu

2、s。實驗表明該菌株有一個廣泛的生長溫度(45-70℃)和pH(5.5-9.5)，最適溫度55℃和最適pH為8.5。
　　 2.克隆表達:將No.6菌株編碼L-阿拉伯糖異構(gòu)酶的基因片段克隆到E.coliBL21(DE3)中進行誘導(dǎo)表達。經(jīng)SDS-PAGE分析檢測重組L-阿拉伯糖異構(gòu)酶蛋白分子量約為56.3kDa，所表達目的蛋白占菌體總蛋白的22.5％。
　　 3.蛋白純化:將誘導(dǎo)好的菌株用超聲波細(xì)胞破碎儀破碎、4℃離心12

3、000rpm離心10min后收集上清液，80℃熱處理10min以去除宿主蛋白，12000rpm離心10min收集上清。由于表達出的蛋白質(zhì)帶有6×His表達標(biāo)簽，可迸一步利用Ni-NTA進行親和柱層析來提純表達出的蛋白質(zhì)。初步純化結(jié)果顯示純酶得率可以達到30mg/L，純度可達到90％以上，并檢測其酶活為26.4 U/mg。
　　 4.酶學(xué)性質(zhì)研究:結(jié)果表明重組的L-阿拉伯糖異構(gòu)酶是一個極端嗜熱嗜堿的異構(gòu)酶，最適溫度和pH分別為95