細(xì)菌纖維素對(duì)兔耳增生性瘢痕影響的實(shí)驗(yàn)研究.pdf

1、研究背景
　　 增生性瘢痕(hypertrophic—scar,HS)是創(chuàng)傷后,尤其是深度燒傷后最常見的一種人類特有的病理性愈合現(xiàn)象。創(chuàng)傷后機(jī)體將啟動(dòng)一系列修復(fù)程序,瘢痕愈合是有多種細(xì)胞和細(xì)胞因子參與修復(fù)的過程,其中尤以成纖維細(xì)胞最為重要,成纖維細(xì)胞(fibroblast,FB)的異常增殖和含Ⅰ、Ⅲ型膠原為主的細(xì)胞外基質(zhì)(extracellarmatrix,ECM)成分的過度沉積、排列紊亂及大量的粘多糖堆積導(dǎo)致瘢痕的形成,所以成

2、纖維細(xì)胞的生物學(xué)行為被認(rèn)為是創(chuàng)傷愈合與瘢痕形成的決定性因素。19世紀(jì)60、70年代Mancini等先后定義這種失控的瘢痕組織:高出皮膚平面但局限在原損傷范圍內(nèi)的為增生性瘢痕。Muir等提出另外的觀點(diǎn),認(rèn)為增生性瘢痕是局限在原創(chuàng)緣內(nèi),不能自動(dòng)消退,切除后易復(fù)發(fā)。
　　 病理性瘢痕包括增生性瘢痕和瘢痕疙瘩,由于增生的瘢痕高出皮膚表面、騷癢、刺痛、色素沉著及攣縮,常常嚴(yán)重影響患者的外觀及功能,給患者的身體和精神帶來嚴(yán)重?fù)p害,對(duì)它的預(yù)防

3、及治療一直是醫(yī)學(xué)領(lǐng)域急待解決的一個(gè)難題,通過不斷的努力我們?cè)隈：鄣姆乐紊先〉昧艘欢ǖ某煽?其手段主要有:手術(shù)治療、激素注射、壓迫治療、放射治療、冷凍治療和硅膠薄貼膜等其它藥物治療。目前臨床上對(duì)于瘢痕的非手術(shù)治療中,類固醇激素,特別是醋酸曲安奈德是一種公認(rèn)療效確切的藥物,常用于瘢痕的局部注射,類固醇激素能有效抑制瘢痕膠原的合成,提高膠原酶活性,并促使膠原分解,但目前存在以下不足:①疼痛；②局部注射后藥物的擴(kuò)散不均；③目前的藥物劑量及使用方

4、法不易控制,長期使用激素的全身副作用明顯；④瘢痕內(nèi)注射只適用于小范圍注射,擴(kuò)大注射面積會(huì)受到單次劑量的限制。所以在瘢痕非手術(shù)治療中,一種無痛的,局部藥物貼膜應(yīng)用是較為理想的方法,在當(dāng)今,盡管對(duì)增生性瘢痕的發(fā)病機(jī)制和治療手段進(jìn)行了大量的研究,但目前仍沒有理想的結(jié)果?；谏鲜鲆?yàn)?尋找一種方便有效的瘢痕治療方法一直是醫(yī)學(xué)工作者奮斗的目標(biāo)。
　　 近幾年,應(yīng)用于增生性瘢痕的生物材料得到醫(yī)學(xué)界的廣泛關(guān)注,其中細(xì)菌纖維素更是關(guān)注的焦點(diǎn)。細(xì)

5、菌纖維素(Bacterial Cellulose,簡稱BC)是目前最細(xì)的天然纖維,屬于納米級(jí)纖維,大小僅為人工合成纖維的1/10,從化學(xué)組成上看,細(xì)菌纖維素與植物纖維素都是由葡萄糖以p-1,4-糖普鍵連接而成的高分子化合物。其結(jié)構(gòu)、理化特性和生化特性等皆與植物纖維素有較大的差異。因?yàn)锽C具有獨(dú)特的生物親和性、相容性、可降解性、適應(yīng)性和無過敏反應(yīng)性以及高的持水性和結(jié)晶度、良好的納米纖維網(wǎng)絡(luò)、高的張力和強(qiáng)度,尤其是良好的機(jī)械韌性,這些優(yōu)良的

6、特性,使細(xì)菌纖維素有著廣泛的商業(yè)用途,如揚(yáng)聲器的振動(dòng)膜、食品添加劑、滲透汽化膜、紙張性能增強(qiáng)劑、傷口護(hù)理敷料等。所以該材料有望成為一種優(yōu)良的創(chuàng)傷愈合敷料。根據(jù)文獻(xiàn)報(bào)道,從兔耳創(chuàng)面上皮化到逐漸出現(xiàn)增生,并在持續(xù)一定時(shí)間后又逐漸消退的過程來看,兔耳創(chuàng)傷愈合與人類創(chuàng)傷愈合的發(fā)生、發(fā)展過程相似。國內(nèi)外已有學(xué)者曾報(bào)道細(xì)菌纖維素對(duì)皮膚創(chuàng)傷的促愈作用方面的相關(guān)實(shí)驗(yàn)研究,但是細(xì)菌纖維素是否能夠?qū)S有治療作用尚無人研究,正基于此我們?cè)O(shè)計(jì)了本實(shí)驗(yàn)。

7、>　　 本實(shí)驗(yàn)內(nèi)容分為兩部分:1.兔耳增生性瘢痕動(dòng)物實(shí)驗(yàn)?zāi)Ｐ偷慕?。?dòng)物瘢痕模型是進(jìn)行瘢痕研究最有用的工具之一,在以往的研究中一般采用成纖維細(xì)胞體外培養(yǎng)體系,包括單層培養(yǎng)和三維培養(yǎng)體系來對(duì)瘢痕進(jìn)行研究,再就是通過臨床觀察來總結(jié)瘢痕的防治經(jīng)驗(yàn),這些研究方法都有一定的缺憾:成纖維細(xì)胞體外培養(yǎng)體系是體外實(shí)驗(yàn),無法很好的模擬體內(nèi)環(huán)境和條件；臨床觀測(cè)無法細(xì)致的研究瘢痕的發(fā)生、發(fā)展、轉(zhuǎn)歸。這些缺點(diǎn)都為更深入的研究瘢痕造成了無法逾越的障礙,因此,建

8、立一種有效的動(dòng)物模型一直是國內(nèi)外醫(yī)學(xué)工作者努力的方向。1997年Morris等報(bào)道:利用兔耳成功建立了增性瘢痕模型,并證實(shí)此模型產(chǎn)生的增生性瘢痕類似于人類增生性瘢痕,能量化的評(píng)價(jià)藥物對(duì)瘢痕的作用。2.細(xì)菌纖維素對(duì)兔耳增生性瘢痕影響的實(shí)驗(yàn)研究。在增生性瘢痕面貼敷細(xì)菌纖維素后觀察不同處理后第0,14,21,28,42,56d瘢痕面大體形態(tài)學(xué)變化、組織學(xué)變化、羥脯氨酸(Hpr)含量,通過實(shí)驗(yàn)研究為細(xì)菌纖維素的臨床運(yùn)用提供基礎(chǔ)理論依據(jù)。

9、　　 目的
　　 1.了解兔耳創(chuàng)面愈合后可否發(fā)生類似人類增生性瘢痕樣的改變。
　　 2.觀察細(xì)菌纖維素對(duì)兔耳增生性瘢痕的療效,以證實(shí)其在減輕瘢痕中所起的作用。
　　 方法：
　　 實(shí)驗(yàn)一:建立兔耳增生性瘢痕模型。
　　 取成年新西蘭白兔30只,以3％戊巴比妥鈉(30mg/kg)靜脈麻醉后用圓規(guī)在每只兔耳皮膚腹側(cè)面刻畫出5個(gè)直徑為1.5cm的圓,內(nèi)外側(cè)各2個(gè),耳根部1個(gè),每個(gè)間隔約1.0cm,避開

10、血管,切除圓內(nèi)皮膚及其下軟骨膜,保留軟骨,每只兔子兩只兔耳有10個(gè)創(chuàng)面,30只兔子共300個(gè)兔耳創(chuàng)面。
　　 實(shí)驗(yàn)二:細(xì)菌纖維素作用于兔耳增生性瘢痕的實(shí)驗(yàn)研究。
　　 術(shù)后第21d左右兔耳創(chuàng)面上皮化且瘢痕增生明顯。此時(shí)根據(jù)每只兔耳5個(gè)瘢痕面隨機(jī)給予不同處理方式設(shè)計(jì)組別:A、B、C、D、E組；A組瘢痕面貼BC(1:5)、B組瘢痕面貼BC(1:6)、C組瘢痕面貼BC(1:8)、D組瘢痕面貼疤痕貼(陽性對(duì)照)、E組瘢痕面未貼任

11、何材料且瘢痕自然生長(陰性對(duì)照)。又按觀察時(shí)間點(diǎn)不同將30只兔子分為6組,每組5只,在給予兔耳瘢痕面不同處理方式后第0d、第14d、第21d、第28d、第42d、第56d觀察每組5只兔子耳朵瘢痕增生情況,大體形態(tài)學(xué)觀察及瘢痕厚度測(cè)量、組織學(xué)光鏡下觀察瘢痕組織成纖維細(xì)胞數(shù)量和膠原纖維結(jié)構(gòu)和α—SMA表達(dá)量、羥脯氨酸(Hpr)含量檢測(cè)。
　　 結(jié)果：
　　 1.大體形態(tài)觀察:給予兔耳瘢痕面不同處理方式后,A、B、C組和陽性對(duì)

12、照D組第14d以前瘢痕面積和厚度均有增加,瘢痕組織顏色增紅,質(zhì)地都有變硬,陰性對(duì)照E組約第21d瘢痕厚度增大到頂峰,各組在高峰期后瘢痕逐漸軟化,A、B、C組瘢痕面積減小、厚度降低、顏色減弱強(qiáng)度低于陽性對(duì)照D組但高于陰性對(duì)照E組。各觀察時(shí)間點(diǎn)A、B、C、D、E組瘢痕組織厚度方差分析結(jié)果(F=21.871,P<0.001),差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義；A、B、C三組兩兩之間差異不具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)；A、B、C三組與陽性對(duì)照D組兩兩之間比

13、較,A、B組與陽性對(duì)照D組兩兩之間差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.001),C組與陽性對(duì)照D組差異不具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)；A、B、C三組和陰性對(duì)照E組差異均具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P≤0.05)；同時(shí)陽性對(duì)照D組和陰性對(duì)照E組差異也具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.001)。
　　 2.組織學(xué)觀察:兔耳創(chuàng)面愈合后初期各組瘢痕明顯高出周圍的正常皮膚,真皮組織增生明顯,表皮下有大量結(jié)締組織增生,增生的真皮中可見大量成纖維細(xì)胞,擴(kuò)張的毛細(xì)血管,較

14、多細(xì)胞外基質(zhì)。不同處理后第14dA、B、C組真皮層變薄,淺層以膠原纖維聚集為主,呈雜亂無序的排列,深層與軟骨平行排列,毛細(xì)血管管腔部分閉塞,成纖維細(xì)胞數(shù)達(dá)到高峰,其量較陰性對(duì)照E組明顯減少,但稍多于陽性對(duì)照D組；處理后第21dA、B、C組可見中量增殖的成纖維細(xì)胞,中量規(guī)則排列的膠原纖維,各組均有程度不等的炎細(xì)胞浸潤,同時(shí)可見較多的上皮細(xì)胞和毛細(xì)血管,此時(shí)陰性對(duì)照E組有大量增殖的成纖維細(xì)胞,大量不規(guī)則的粗大膠原纖維呈漩渦狀排列或結(jié)節(jié)狀排列

15、,成纖維細(xì)胞數(shù)達(dá)到高峰；處理后第28,42,56d各組成纖維細(xì)胞數(shù)含量較前減少,A、B、C三組成纖維細(xì)胞數(shù)量分別比較A>B>C(P≤0.05),A、B、C三組膠原纖維結(jié)構(gòu)比較差異不具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(p>0.05),A、B、C組膠原排列較陰性對(duì)照E組整齊,但仍次于陽性對(duì)照D組。各組α—SMA表達(dá)量測(cè)定:各組在不同處理后第0dα—SMA表達(dá)為一般陽性,隨著時(shí)間延長,各組α—SMA表達(dá)數(shù)量呈上升趨勢(shì),A、B、C、D組第14d達(dá)到最高峰,而E組中

16、α—SMA的高峰期表達(dá)陽性持續(xù)到第21d,在高峰期E組表達(dá)呈強(qiáng)陽性、A、B、C組中表達(dá)呈陽性、D組表達(dá)呈弱陽性,再隨著時(shí)間的延長,高峰期后各組α—SMA陽性細(xì)胞表達(dá)數(shù)量減少,其中E組減少最小,其他各組減少較大,據(jù)此陽性表達(dá)強(qiáng)度D　　 3.增生性瘢痕Hpr含量:不同處理方式后各組Hpr含量均呈現(xiàn)先增后減的趨勢(shì),A、B、C、D組在處理后第14d左右Hpr含量達(dá)到高峰期,

17、E組在處理后第21d達(dá)到高峰,各處理后時(shí)間點(diǎn)A、B、C、D、E五組Hpr含量方差分析結(jié)果顯示差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(F=50.666 P<0.001);A、B、C三組兩兩之間差異不具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)；A、B、C三組與陽性對(duì)照D組兩兩之間比較,A、B組與陽性對(duì)照D組兩兩之間差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P≤0.05),C組與陽性對(duì)照D組差異不具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)；A、B、C三組和陰性對(duì)照E組差異均具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.001)；

18、同時(shí)陽性對(duì)照D組和陰性對(duì)照E組差異也具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.001)。
　　 結(jié)論：
　　 1.本實(shí)驗(yàn)兔耳腹面的全層皮膚缺損愈合后,可以產(chǎn)生與人增生性瘢痕的組織學(xué)結(jié)構(gòu)類似的增生塊,增生塊的持續(xù)時(shí)間也與人的增生性瘢痕持續(xù)時(shí)間相似,進(jìn)一步驗(yàn)證了增生性瘢痕動(dòng)物模型。
　　 2.外用細(xì)菌纖維素敷料有效抑制了兔耳創(chuàng)面愈合后增生性瘢痕的形成,效果比較明顯。
　　 3.外用細(xì)菌纖維素敷料減輕兔耳增生性瘢痕的效果不如疤痕