三苯氧胺軟膏對(duì)兔耳增生性瘢痕影響的實(shí)驗(yàn)研究.pdf

1、目的：利用手術(shù)創(chuàng)傷的方法在兔耳腹側(cè)建立增生性瘢痕動(dòng)物模型，局部應(yīng)用三苯氧胺軟膏對(duì)其進(jìn)行實(shí)驗(yàn)性治療。觀察三苯氧胺對(duì)兔耳增生性瘢痕中成纖維細(xì)胞、膠原纖維、血管內(nèi)皮細(xì)胞生長(zhǎng)因子及羥脯氨酸含量的影響，探討三苯氧胺軟膏抑制瘢痕增生的作用，評(píng)價(jià)其抗瘢痕增生的臨床潛能。 方法： 1實(shí)驗(yàn)動(dòng)物：健康成年新西蘭白兔24只，雌雄不拘，雌兔未孕，稱(chēng)重，編號(hào)。 2實(shí)驗(yàn)動(dòng)物分組：將新西蘭白兔隨機(jī)分為3組：對(duì)照組、實(shí)驗(yàn)組A(1％TAM)及實(shí)驗(yàn)

2、組B(2％TAM)，每組8只。 3麻醉：用10％水合氯醛溶液做腹腔注射麻醉，麻醉成功后固定于操作臺(tái)上。 4建立兔耳增生性瘢痕模型：碘附消毒兔耳腹側(cè)，在每只兔耳腹面避開(kāi)血管做4個(gè)1.0cm×1.0cm大小方形的全層皮膚缺損創(chuàng)面，深至軟骨表面。創(chuàng)面之間相距1cm，共做創(chuàng)面192個(gè)。術(shù)畢無(wú)菌紗布包扎創(chuàng)面，每日以碘附擦拭消毒直至創(chuàng)面愈合，共形成增生性瘢痕142處。 5藥物實(shí)驗(yàn)：3組動(dòng)物每組選40個(gè)增生性瘢痕于術(shù)后第15天

3、開(kāi)始外涂藥物。 6標(biāo)本制作：瘢痕涂藥30天、60天時(shí)各組分別隨機(jī)取15個(gè)瘢痕塊，用無(wú)菌保險(xiǎn)刀片自瘢痕的最高點(diǎn)垂直于耳軟骨方向切開(kāi)，將每個(gè)標(biāo)本均分為兩塊，固定于4％多聚甲醛中，常規(guī)石蠟包埋切片，分別行常規(guī)HE染色、VG染色及免疫組化。瘢痕涂藥60天后對(duì)照組和實(shí)驗(yàn)組B分別隨機(jī)取3個(gè)瘢痕塊，沿瘢痕凸起最高點(diǎn)取0.3cm×0.3cm的組織，做透射電鏡。 7觀測(cè)指標(biāo)：(1)大體觀察。(2)測(cè)量瘢痕增生指數(shù)。(3)成纖維細(xì)胞數(shù)密度N

4、A(Numericaldensityonarea)：400倍光鏡下觀察HE染色切片，每個(gè)標(biāo)本隨機(jī)選5個(gè)視野(0.0052mm2/視野)，目測(cè)計(jì)數(shù)并計(jì)算切片內(nèi)單位面積成纖維細(xì)胞數(shù)量，結(jié)果取均數(shù)。(4)膠原纖維面密度AA(Areadensityonarea)：200倍光鏡下觀察標(biāo)本VG染色切片，隨機(jī)選取5個(gè)視野，利用計(jì)算機(jī)輔助病理圖象分析系統(tǒng)計(jì)算紅染的膠原纖維的面密度，結(jié)果取均數(shù)。(5)對(duì)免疫組化染色切片，光鏡觀察VEGF分布，200倍光鏡

5、下隨機(jī)選取5個(gè)矩形視野以光密度200為背底，用計(jì)算機(jī)輔助病理圖象分析系統(tǒng)測(cè)量平均光密度和積分光密度值并進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)處理。(6)根據(jù)試劑盒說(shuō)明測(cè)量瘢痕組織內(nèi)羥脯氨酸含量(HPr)。(7)透射電鏡下觀察對(duì)照組與實(shí)驗(yàn)組B間成纖維細(xì)胞的超微結(jié)構(gòu)變化。 結(jié)果： 1大體觀察：本實(shí)驗(yàn)兔耳增生性瘢痕動(dòng)物模型共形成增生性瘢痕142個(gè)，瘢痕的發(fā)生率為74％。用藥30、60天后，對(duì)照組瘢痕組織呈山丘樣隆起，高出正常皮膚，顏色為紫紅色，質(zhì)地硬韌，

6、但皮損邊緣并不超過(guò)原手術(shù)損傷的范圍。實(shí)驗(yàn)組A瘢痕組織呈平臺(tái)樣隆起，高出正常皮膚，顏色呈深紅色，質(zhì)地較軟，個(gè)別瘢痕塊體積減小不明顯。實(shí)驗(yàn)組B稍隆起于正常皮膚，體積明顯減小，多呈粉紅色，質(zhì)地較柔軟。 2瘢痕增生指數(shù)：各組瘢痕均厚于正常皮膚，瘢痕增生指數(shù)：用藥30天：對(duì)照組3.57±0.77；實(shí)驗(yàn)組A3.01±0.44；實(shí)驗(yàn)組B2.94±0.55。用藥60天：對(duì)照組3.32±0.65；實(shí)驗(yàn)組A2.73±0.21；實(shí)驗(yàn)組B2.21±0.

7、33。30天，60天時(shí)3組間差異均有顯著性(P＜0.05)，隨著藥物濃度的增加，瘢痕增生指數(shù)下降。 3膠原纖維面密度：對(duì)照組膠原纖維染色增強(qiáng)，粗大，排列紊亂，并可見(jiàn)呈漩渦狀排列，纖維走行互不平行、雜亂無(wú)章。實(shí)驗(yàn)組A膠原纖維結(jié)構(gòu)較緊密，組織排列較規(guī)整，局部交錯(cuò)排列?；酒叫杏诒砥づ帕校胁糠掷w維排列紊亂。實(shí)驗(yàn)組B膠原染色少，纖維纖細(xì)，組織排列疏松，分布不均，著色深淺不一，大多與表皮平行排列。對(duì)照組膠原纖維面密度高于實(shí)驗(yàn)組(P＜0

8、.05)，實(shí)驗(yàn)組A高于實(shí)驗(yàn)組B(P＜0.05)。 4成纖維細(xì)胞數(shù)密度NA：成纖維細(xì)胞數(shù)密度：用藥30天，對(duì)照組4555.6±327.8，實(shí)驗(yàn)組A3447.8±296.6，實(shí)驗(yàn)組B2840.6±288.3：用藥60天，對(duì)照組4758.2±305.6，實(shí)驗(yàn)組A3341.7±3110.8，實(shí)驗(yàn)組B2632.3±266.7。30天，60天時(shí)實(shí)驗(yàn)組與對(duì)照組間差異有顯著性(P＜0.05)，NA隨藥物濃度的增加而減少。對(duì)照組有大量著色較深的成

9、纖維細(xì)胞及細(xì)胞基質(zhì)，成纖維細(xì)胞胞體較大，較多毛細(xì)血管生成，血管內(nèi)皮細(xì)胞肥大，細(xì)胞總量比實(shí)驗(yàn)組A及B組多(P＜0.05)。實(shí)驗(yàn)組A有較多著色較深的成纖維細(xì)胞及細(xì)胞基質(zhì)，毛細(xì)血管較前減少，成熟的成纖維細(xì)胞較多，排列比較整齊。實(shí)驗(yàn)組B，成熟的成纖維細(xì)胞占多數(shù)，細(xì)胞數(shù)量較A組明顯減少(P＜0.05)排列成束狀，毛細(xì)血管較少。 5透射電鏡觀察：對(duì)照組：成纖維細(xì)胞呈長(zhǎng)梭形，體積較大，核呈長(zhǎng)橢圓形，位于細(xì)胞中央，染色質(zhì)豐富，異染色質(zhì)較少，可見(jiàn)

10、明顯的核仁。細(xì)胞質(zhì)豐富，充滿(mǎn)同心圓排列、高度擴(kuò)張的粗面內(nèi)質(zhì)網(wǎng)、線粒體。粗面內(nèi)質(zhì)網(wǎng)囊內(nèi)可見(jiàn)分泌的蛋白粒子，其周?chē)写罅磕z原纖維。實(shí)驗(yàn)組B：成纖維細(xì)胞周?chē)猩倭康哪z原纖維，核呈橢圓形，部分核膜融合消失。細(xì)胞質(zhì)內(nèi)粗面內(nèi)質(zhì)網(wǎng)部分?jǐn)U張呈池狀，線粒體變性，部分嵴與膜融合。 6免疫組化VEGF染色結(jié)果圖象分析：30天，60天時(shí)對(duì)照組、實(shí)驗(yàn)組A、實(shí)驗(yàn)組B的VEGF陽(yáng)性信號(hào)灰度均有差異，隨著藥物濃度的增加，逐漸減少，VEGF陽(yáng)性信號(hào)灰度降低差異有

11、顯著性(P＜0.05)。 7HPr含量：用藥30天：對(duì)照組10.9±0.54；實(shí)驗(yàn)組A9.34±0.32；實(shí)驗(yàn)組B7.63±0.26。用藥60天：對(duì)照組9.93±0.42；實(shí)驗(yàn)組A8.74±0.27；實(shí)驗(yàn)組B7.03±0.15。30天，60天時(shí)實(shí)驗(yàn)組與對(duì)照組間均有差異，隨著藥物濃度的增加，HPr含量降低差異有顯著性(P＜0.05)。 結(jié)論：應(yīng)用三苯氧胺軟膏對(duì)兔耳增生性瘢痕進(jìn)行治療可抑制成纖維細(xì)胞的增殖，明顯減少膠原纖維生