中國(guó)主要出口蝦類的分子鑒定標(biāo)記研究.pdf

1、蝦的種類繁多，僅聯(lián)合國(guó)糧農(nóng)組織（FAO）列出的具有商業(yè)或具有潛在商業(yè)價(jià)值的蝦就有300多種，為重要的經(jīng)濟(jì)水產(chǎn)品之一。據(jù)FAO統(tǒng)計(jì)，全球每年捕撈和養(yǎng)殖蝦的產(chǎn)量約為600萬(wàn)噸，其中約60％進(jìn)行國(guó)際貿(mào)易。目前蝦產(chǎn)品年出口值超過(guò)140億美元，占漁業(yè)總出口值的16％，在國(guó)際貿(mào)易中具有重要地位。當(dāng)前，中國(guó)沿海養(yǎng)殖和捕撈（含海水和淡水）的蝦主要有斑節(jié)對(duì)蝦（Penaeus.momodon）、凡納對(duì)蝦（Penaeus vannamei）、中國(guó)對(duì)蝦（Pen

2、aeus.chinensis）、日本對(duì)蝦（Penaeus japonica）、羅氏沼蝦（Maeobrachium rosenbergii）、墨吉對(duì)蝦（Penaeus merguiensis）、中華管鞭蝦（Solenocera crassicornis）、鷹爪蝦（Trachypenaeus curvirostris）、克氏原螯蝦（Procambarus clarkii）等，年出口量近30萬(wàn)噸，產(chǎn)值近17億美元。
　　 近年來(lái)，國(guó)際

3、上對(duì)貿(mào)易品種的要求日益嚴(yán)格，物種鑒定已成為出口農(nóng)產(chǎn)品、食品的技術(shù)性貿(mào)易壁壘之一。通常，蝦類的品種鑒定主要依據(jù)形態(tài)學(xué)標(biāo)準(zhǔn)（如外形、顏色等）來(lái)進(jìn)行。然而當(dāng)用于形態(tài)辨別的部分被去除、形態(tài)非常相近或未形成可辨別形態(tài)時(shí)，蝦類的品種鑒定則顯得非常困難，因此采用分子鑒定標(biāo)記進(jìn)行品種鑒定的研究日益引起重視，如核糖體轉(zhuǎn)錄間隔區(qū)、線粒體細(xì)胞色素氧化酶C基因、線粒體細(xì)胞色素b基因等。
　　 本研究首先利用蝦類核糖體基因高度保守的18s、28s和中間的

4、5.8s區(qū)域，設(shè)計(jì)出了通用引物，對(duì)中國(guó)幾種主要出口蝦類ITS1區(qū)域進(jìn)行PCR擴(kuò)增并測(cè)序。根據(jù)測(cè)序結(jié)果，篩選出了合適的選擇性內(nèi)切酶，針對(duì)所研究各蝦品種的ITS1序列產(chǎn)生出特異性的酶切圖譜，將它們作為分子標(biāo)簽，應(yīng)用于中國(guó)主要出口蝦類品種及其產(chǎn)地的快速鑒定，具有特異性強(qiáng)、重復(fù)性高、檢測(cè)時(shí)間短、成本低的特點(diǎn)。在該部分研究中，利用所設(shè)計(jì)的引物，所得到蝦類ITS1長(zhǎng)度變化在448 bp（戴氏赤蝦）到1491 bp（日本沼蝦）之間，GC含量為40.9

5、5-66.83％，其中戴氏赤蝦和日本沼蝦的ITS1序列為目前所報(bào)道的最短和最長(zhǎng)的蝦類ITS1序列。各蝦品種的ITS1序列比較發(fā)現(xiàn)，微衛(wèi)星序列大多出現(xiàn)在5’端和中間區(qū)域。同一種蝦品種的微衛(wèi)星序列差異與群體間ITS1的變異和長(zhǎng)度多態(tài)性緊密相關(guān)，而且對(duì)蝦科對(duì)蝦屬各蝦品種比較發(fā)現(xiàn)，親緣關(guān)系越近，其微衛(wèi)星序列相似度越高。對(duì)蝦科5個(gè)蝦品種之間可用ITS1數(shù)據(jù)進(jìn)行很好的區(qū)分。此外，結(jié)合PCR-RFLP技術(shù)，不同蝦品種的ITS1序列可產(chǎn)生特定的酶切片段

6、，可以此對(duì)它們進(jìn)行有效區(qū)分。這些結(jié)果表明，ITS1序列作為一個(gè)重要的分子標(biāo)簽，在不同分類水平上具有很高的變異性，在蝦類品種鑒定和系統(tǒng)發(fā)育研究中具有重要的作用。
　　 本研究還采用熒光標(biāo)記引物的AFLP分析方法，對(duì)中國(guó)主要出口蝦類資源進(jìn)行了遺傳變異和品種鑒別研究，依據(jù)AFLP標(biāo)記的數(shù)據(jù)結(jié)果，我們對(duì)對(duì)蝦科下不同屬的蝦類系統(tǒng)親緣關(guān)系進(jìn)行了分析。結(jié)果顯示：在遺傳距離上，日本對(duì)蝦（P.japonicus）和寬溝對(duì)蝦（P.monodon）之

7、間最小，為0.214：中華管鞭蝦（S.crassicornis）和鷹爪蝦（T.curvirostris）之間最大，為0.659；遺傳一致度上，日本對(duì)蝦（P.japonicus）和寬溝對(duì)蝦（P.monodon）最近，為0.787；管鞭蝦科的中華管鞭蝦（S.crassicornis）和對(duì)蝦科鷹爪蝦屬的鷹爪蝦（T.curvirostris）之間最遠(yuǎn)，為0.341。二種分析方法結(jié)果基本一致，說(shuō)明基于AFLP標(biāo)記揭示的不同蝦類之間的遺傳距離比較穩(wěn)

8、定。依據(jù)Jaccard遺傳相似性系數(shù)構(gòu)建對(duì)蝦科下所有供試蝦樣品的UPGMA系統(tǒng)聚類關(guān)系圖，其中中華管鞭蝦（S.crassicornis）作為Outgroup單元對(duì)照，獨(dú)立在外，成一個(gè)單獨(dú)的分支，所有對(duì)蝦科蝦類均聚為一類，在Jaccard遺傳相似性系數(shù)為0.38處，對(duì)蝦科內(nèi)不同屬蝦類可進(jìn)一步細(xì)分為三大分支。第1分支主要由哈氏仿對(duì)蝦（P.hardwickii）、刀額新對(duì)蝦（M.ensis）和戴氏赤蝦（M.dalei）三類組成：第Ⅱ分支主要由

9、寬溝對(duì)蝦（P.latisulcatus）、同本對(duì)蝦（P.japonicus）和凡納濱對(duì)蝦（L.vannamei）組成；第Ⅲ分支僅由鷹爪蝦（T.curvirostris）組成。這表明利用.AFLP標(biāo)記可以揭示不同蝦類之間的遺傳差異程度，分析物種之間的系統(tǒng)親緣關(guān)系。
　　 本研究中12對(duì)引物共擴(kuò)增出了841條DNA譜帶，所有條帶的分子量范圍在50～550bp之間，其中601條為多態(tài)性條帶，多態(tài)性位點(diǎn)百分率為71.5％，平均每對(duì)引物擴(kuò)

10、增出70.1條總帶和50.1條多態(tài)性條帶。相比于其它研究者采用AFLP標(biāo)記對(duì)對(duì)蝦科蝦類的分析結(jié)果來(lái)說(shuō)，多態(tài)性位點(diǎn)百分率相對(duì)偏高。在引物鑒別效率方面，12對(duì)AFLP引物中可將所有供試蝦樣品100％區(qū)分開(kāi)的引物組合有4對(duì)：E-ACG/M-CAA、E-AGG/M-CTA、E-AGG/M-CTC和E-AGG/M-CTT，12對(duì)引物的平均鑒別效率達(dá)92.8％，可見(jiàn)AFLP標(biāo)記用于蝦種水平上的鑒別效率非常高，這也間接反映出不同蝦之間的遺傳背景差異較