基于金納米樹(shù)脂復(fù)合微球檢測(cè)肺癌標(biāo)志物的電化學(xué)和SERS研究.pdf

1、樹(shù)脂微球因其具有形貌和大小可控，良好的穩(wěn)定性及生物相容性等特征，其在生物醫(yī)學(xué)領(lǐng)域的應(yīng)用引起廣泛的關(guān)注。樹(shù)脂微球攜帶多種活性基團(tuán)(如羥基、醛基、羧基、氨基等)，既可以進(jìn)行化學(xué)修飾而實(shí)現(xiàn)不同的功能，也可以直接偶聯(lián)生物酶、抗體及藥物。本論文主要研究以多巴胺、氨基水楊酸、血清胺和色氨酸四種單體來(lái)制備樹(shù)脂微球，并以其為模板制備出了金納米樹(shù)脂復(fù)合微球。金納米樹(shù)脂復(fù)合微球是將金納米顆粒修飾到樹(shù)脂微球上形成的復(fù)合材料，因其導(dǎo)電性強(qiáng)和表面增強(qiáng)拉曼散射(S

2、urface enhanced Raman scattering，SERS)活性高而被應(yīng)用到電化學(xué)和SERS分析領(lǐng)域。篩選出具有可區(qū)分的電化學(xué)和SERS特征峰的分子標(biāo)記到金納米樹(shù)脂復(fù)合微球上，構(gòu)建基于電化學(xué)和SERS檢測(cè)技術(shù)的免疫傳感器來(lái)檢測(cè)一種或多種肺癌標(biāo)志物。
　　本論文具體開(kāi)展了如下工作:
　　1.以多巴胺、氨基水楊酸、血清胺和色氨酸四種反應(yīng)單體來(lái)制備不同粒徑的樹(shù)脂微球。研究反應(yīng)單體的量對(duì)合成樹(shù)脂微球形貌的影響;討論了

3、化學(xué)結(jié)構(gòu)與樹(shù)脂微球粒徑的大小關(guān)系。將金納米顆粒修飾到樹(shù)脂微球上形成金納米樹(shù)脂復(fù)合微球。研究并討論了不同濃度的氯金酸對(duì)樹(shù)脂微球上金納米顆粒形貌的影響。樹(shù)脂微球上的金納米顆粒之間存在著微小的距離，這可以產(chǎn)生很強(qiáng)的“熱點(diǎn)”效應(yīng)有利于增強(qiáng)SERS信號(hào)。金納米樹(shù)脂復(fù)合微球上的金納米顆粒具有良好的導(dǎo)電性和SERS活性，可以將其應(yīng)用到電化學(xué)和SERS分析領(lǐng)域。
　　2.首次提出將金納米樹(shù)脂復(fù)合微球固載在經(jīng)硫堇處理的玻碳電極表面，通過(guò)硫堇電化學(xué)信

4、號(hào)的改變，發(fā)展了一種檢測(cè)癌胚抗原(Carcinoembryonic antigen，CEA)的新方法。其特點(diǎn)在于:第一，金納米樹(shù)脂復(fù)合微球具有比表面積大的特點(diǎn)，可以有效增大電極的表面積并提高CEA抗體(CEA antibody, anti-CEA)的固載量。第二，金納米樹(shù)脂復(fù)合微球表面含有豐富的活性基團(tuán)，anti-CEA不僅可以通過(guò)蛋白質(zhì)分子上氨基或巰基與金形成金氮鍵或金硫鍵而將anti-CEA共價(jià)吸附在工作電極表面，而且還可以通過(guò)復(fù)合

5、微球與蛋白質(zhì)分子上的羧基氨基發(fā)生縮合反應(yīng)而固定抗體，進(jìn)一步提高anti-CEA的固載量。第三，金納米樹(shù)脂復(fù)合微球的導(dǎo)電性能強(qiáng)，可以提高電活性物質(zhì)與電極之間的電子傳遞速率，提高該免疫傳感器的檢測(cè)靈敏度。實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，該免疫傳感器制作方法簡(jiǎn)單，固化抗體分子保持良好，靈敏度高，抗干擾性強(qiáng)，可用于CEA的分析檢測(cè)。
　　3.基于普魯士藍(lán)(Prussian blue，PB)和甲苯胺藍(lán)(Toluidine blue，TB)不同的電化學(xué)活性，將

6、PB和TB修飾到金納米樹(shù)脂復(fù)合微球表面，發(fā)展了一種基于電化學(xué)分析技術(shù)同時(shí)檢測(cè)兩種肺癌標(biāo)志物-CEA和神經(jīng)烯醇化酶(Neuronal specific enolase，NSE)的生物傳感新方法。本研究使用一種氟摻雜氧化錫(Fluorine-doped tin oxide，F(xiàn)TO)導(dǎo)電玻璃作為工作電極，通過(guò)氨基功能化使工作電極表面形成一層富含氨基的膜，進(jìn)一步將PB和TB修飾的金納米樹(shù)脂復(fù)合微球分別固定到工作電極上，隨后anti-CEA和神經(jīng)

7、烯醇化酶抗體(NSE antibody，anti-NSE)共價(jià)吸附在工作電極上，制得一種同時(shí)檢測(cè)CEA和NSE的電化學(xué)免疫傳感器。本實(shí)驗(yàn)對(duì)制備PB和TB修飾的金納米樹(shù)脂復(fù)合微球及其標(biāo)記的免疫傳感器做了電化學(xué)表征，并對(duì)免疫傳感器的實(shí)驗(yàn)條件進(jìn)行優(yōu)化。在最優(yōu)化條件下，該免疫傳感器檢測(cè)CEA和NSE的最低檢測(cè)限分別是0.11 ng/mL和0.08 ng/mL。
　　4.為了避免信號(hào)分子發(fā)生氧化還原反應(yīng)和提高檢測(cè)的穩(wěn)定性，基于納米結(jié)構(gòu)的SE

8、RS效應(yīng)，利用拉曼信號(hào)分子在金納米樹(shù)脂復(fù)合微球表面吸附，發(fā)展一種基于SERS技術(shù)檢測(cè)一種或兩種肺癌標(biāo)志物的新方法。本研究將生物相容性好的殼聚糖穩(wěn)定的金納米顆粒固定在基底表面，用于捕獲抗體的固載，可有效保持其生物活性。利用金納米樹(shù)脂復(fù)合微球的大比表面積，可提高標(biāo)記抗體的固載量及其與識(shí)別抗原的結(jié)合效率，將信號(hào)分子(尼羅藍(lán)A，Nile blue A，NBA)和標(biāo)記抗體修飾到金納米樹(shù)脂復(fù)合微球表面形成標(biāo)記探針。本研究成功構(gòu)建了一個(gè)雙抗夾心式SE

9、RS免疫探針來(lái)檢測(cè)溶液中CEA的濃度。同時(shí)，利用兩種具有可區(qū)分SERS特征峰的拉曼信號(hào)分子(4-巰基苯甲酸和NBA)，構(gòu)建一個(gè)可以同時(shí)檢測(cè)兩種肺癌標(biāo)志物的SERS免疫探針。
　　5.提出了一種基于金納米樹(shù)脂復(fù)合微球雙模式、高通量檢測(cè)肺癌標(biāo)志物的方法，并用電化學(xué)和SERS系統(tǒng)地表征檢測(cè)信號(hào)的變化。經(jīng)過(guò)一系列的篩選，選擇兩種具有可區(qū)分的電化學(xué)和SERS特征峰的硫堇和NBA，將其標(biāo)記到金納米樹(shù)脂復(fù)合微球上構(gòu)建一個(gè)電化學(xué)和SERS雙模式的

10、免疫傳感器，實(shí)現(xiàn)了對(duì)CEA和細(xì)胞角蛋白19片段(Cytokeratin19fragment，CK-19)的定量檢測(cè)。采用雙抗夾心法，標(biāo)記探針、目標(biāo)抗原和捕獲探針通過(guò)抗體-抗原-抗體特異性免疫反應(yīng)形成免疫復(fù)合物。當(dāng)免疫復(fù)合物形成后，就可以將其放置于電化學(xué)工作站或者拉曼光譜儀下進(jìn)行電化學(xué)或SERS檢測(cè)。免疫傳感器在電化學(xué)模式下可以檢測(cè)到CEA和CK-19的最低濃度分別為0.01 ng/mL和0.04 ng/mL;在SERS模式下檢測(cè)到CEA