新型陽離子聚合物聚磷酰胺的合成及作為基因-siRNA轉運載體的體外實驗研究.pdf

1、研究目的：
　　本研究的目的是人工化學合成一種低毒、高效的樹枝狀陽離子聚合物作為基因或siRNA的轉移載體，通過體外一系列的化學和細胞學實驗檢測其作為基因或siRNA的轉移載體的特性以及在多種細胞中對質粒及siRNA的轉染效率以及在轉染過程中所產生的毒性作用。上述研究將為該陽離子聚合物作為基因或siRNA的轉移載體用于臨床基因治療相關疾病奠定理論基礎。
　　研究方法：
　　二氯磷酸乙酯和N-（2-氨乙基）-N（1-甲基

2、）-1，2-乙二胺在氮氣保護下，聚合48h，得到陽離子聚磷酰胺(PPA)轉染試劑。然后通過過表達（質粒）或干擾表達(si RNA)的策略探討聚磷酰胺(PPA)包裹的PKD2表達質粒在A549細胞（人類肺癌細胞系）和HEK293（人類胚胎腎細胞）中的轉染效率;通過CCK8檢測細胞在含有這種新型轉染試劑的培養(yǎng)基中的增殖情況，確定它的細胞增殖毒性;經免疫熒光染色、流式細胞儀檢測、Western blot等方法證實聚磷酰胺(PPA)包裹的PKD

3、2質粒和siRNA進入了細胞中，且能表達相應的靶蛋白，導入的siRNA能靶向性敲低基因的表達，從而證實該新型陽離子聚合物轉染試劑有良好的轉染效率。
　　研究結果：
　　1.聚磷酰胺聚合物的化學合成和核磁共振光譜測定
　　PPA是由二氯磷酸乙酯和N-（2-氨乙基）-N（1-甲基）-1，2-乙二胺在氮氣保護下聚合得到。PPA的化學結構由核磁共振光譜來(NMR spectra)鑒定。在聚合物1H NMR譜圖中，δ=4.512

4、-4.72ppm和1.09-1.31ppm處為亞甲基和甲基(-POCH2CH3)的氫質子峰;δ=2.62-3.08ppm是亞甲基和甲基(-NCH2CH2)N(CH3)CH2CH2N-)的氫質子峰。我們進一步測定了聚合物的31p核磁共振光譜(31p NMR)。PPA的共振最高為δ=10.02 ppm，說明二氯磷酸乙酯和N-（2-氨乙基）-N（1-甲基）-1，2-乙二胺進行縮聚得到聚磷酰胺。
　　2.聚磷酰胺結合DNA能力檢測

5、　　為了證明PPA對DNA的結合能力，即證明PPA和pDNA復合物的形成。用含EB(溴化乙錠)的1.0％的凝膠來進行凝膠阻滯電泳，發(fā)現低濃度的PPA(0.5μg/μL)和高濃度的PPA（1μg/μL）分別與0.5μg的pDNA形成的聚合物顯示，在特定的N/P比率下PPA能夠有效的包裹pDNA，在N/P比率為8和更高的比率下PPA/pDNA會完全的滯留在上樣孔上。當pDNA的濃度為1.0μg情況下，在比N/P為4或者更高的N/P比率時復合

6、物完全失去了移動的能力，表明合成的聚磷酰胺能有效包裹DNA分子。
　　3.PPA/pDNA復合物顆粒大小和電極電位測定
　　PPA/pDNA多聚體混合物的粒子大小和電極電位已被證明影響細胞吸收，內吞作用通路，入核作用和轉染效率[24，25]。多種不同重量比(N/P比率)的PPA/pDNA多聚體復合物的合成是通過將pDNA和PPA溶液在pH7.4的10 mMTris-HC1緩沖液中配成的。該PPA/pDNA多聚體混合物不同重量

7、比(N/P比率)的顆粒大小和多聚復合物的電極電位測量是通過Nano-ZS ZEN3600檢測的。所有的PPA/pDNA多聚體混合物的大小測量范圍都是在1∶1至16∶1的重量比范圍，所有的PPA/pDNA多聚體混合物的直徑范圍大小在100到166nm之間。我們同時發(fā)現隨著N/P比率增加，PPA/pDNA多聚體混合物的直徑會出現輕微的下降。
　　進一步我們通過Nano-ZS ZEN3600的電極電位分析能力與動態(tài)光散射能力來測定PPA

8、結合的質粒DNA的電極電位，隨著PPA/pDNA多聚體混合物的N/P比率的增加，混合物的電壓也從26.6mv上升到38.4mv。由于核酸都是帶有負電荷的，通過靜電作用，因此帶有正電荷的PPA/pDNA多聚體混合物更加容易用于細胞實驗。
　　4.聚磷酰胺(PPA)的細胞毒性檢測
　　為了探討PPA的毒性作用，我們進行CCK-8毒性測試以期了解不同濃度的PPA對人類肺癌細胞A549和人類腎胚胎細胞HEK293的毒性作用。PPA的

9、測試濃度范圍是在15-30μg/mL。在PPA濃度為15μg/mL情況下，與DMSO對照組相比較，經PPA處理的A549細胞和HEK293細胞在數量、形態(tài)等方面并未有明顯的不同。并且在PPA濃度為30μg/mL情況下，與DMSO對照組相比，A549細胞和HEK293細胞仍然具有相對較低的毒性，并且我們發(fā)現PPA在HEK293細胞中比在A549細胞中具有較低的毒性。
　　為了進一步明確PPA的毒性與孵育時間的相關性，HEK293細胞

10、在PPA濃度為15μg/mL時，分別孵育12h，24h，36h。在不同的時間段，我們發(fā)現在15μg/mLPPA濃度下，HEK293細胞和DMSO對照組相比并沒有明顯的細胞毒性。綜上所述，PPA體外測試表明PPA細胞毒性作用低從而有望成為理想的體內或者是體外基因轉移載體。
　　5.聚磷酰胺(PPA)介導的質粒轉染效率和生物功能活性檢測
　　我們利用PPA包裹帶有GFP標簽的pEGFP質粒，并轉染HEK293細胞。熒光顯微鏡顯示

11、在N/P比率為3∶1時，PPA顯示出與商用化的轉染試劑Lipofectamine2000和Hilymax相比較的轉染效率和相似的GFP熒光強度。流式細胞儀進一步定量顯示PPA轉染的細胞中GFP的熒光量達64％，與Lipofectamine2000(62％)相當，而高于Hilymax(48％)。
　　PKD的磷酸化可特異性激活NF-κB信號通路，其中IκB的降解是NF-κB信號通路激活的關鍵[26-28]。為此，我們使用PKD的特異

12、性激動劑PMA作刺激因子，探討PPA包裹的外源性質粒PKD2的轉染，是否能有效表達PKD2蛋白，該蛋白是否受PMA的激活，繼而激活下游NF-KB信號通路。Western blot檢測表明，PPA能有效將外源性的GFP-PKD2質粒高效的轉染進入A549細胞中，并且過表達PKD2。同時，PMA處理細胞30min后，能明顯提高內源性和外源性PKD在 S744/748磷酸化位點的磷酸化水平，而且，在PMA的刺激下，外源性GFP-PKD2的過表

13、達明顯降低IκB的表達水平，表明PKD的表達和激活促進IκB的降解。上述研究提示PPA能夠有效的轉移外源基因到靶細胞內，并有效地表達和激活下游信號通路，從而在細胞中執(zhí)行特定的功能。
　　為了進一步證實PPA是否可以同時包裹多個外源基因，且高效地轉染進靶細胞中，并在細胞中仍具有生物功能活性。我們利用PPA包裹，然后將NF-KB熒光酶素報告基因（NF-κB-luc）及內參照報告基因海腎熒光素酶[pGL4.74(hRluc/TK)]分別

14、與pEGFP、GFP-PKD2共轉染HEK293細胞。血清饑餓16小時后，兩組細胞在有無PMA的刺激作用下處理12小時，收集細胞裂解液，進行雙色熒光素酶活性檢測。各組細胞的螢火蟲熒光素酶活性與海腎熒光素酶活性的比值用相對熒光素酶活性(RLU)表示。結果表明，與pEGFP轉染的對照組相比，GFP-PKD2的表達明顯增加PMA刺激的NF-κB的轉錄激活活性。上述結果提示PPA能有效地包裹和轉染多個外源基因進入靶細胞，外源基因的表達和激活能有

15、效地促進下游信號通路的激活，進而最終促進與之相關的靶基因的轉錄激活活性。
　　6.PPA介導的siRNA的轉染及蛋白核轉位檢測
　　為了進一步證實PPA是否同樣具有包裹并有效轉染siRNA，我們同樣將PPA和siRNA以一定的比率(N/siRNA)混合，然后將其轉染人肺癌A549細胞和HeLa細胞，孵育2天。Western blotting檢測顯示:在A549和HeLa細胞中，經PPA導入的siRNA-PKD2均能明顯地敲低

16、內源性PKD2的表達。為了進一步明確敲低內源性PKD2的表達是否影響TNF-α生理刺激作用對NF-κB的核轉位，我們用PPA分別包裹siCTL（對照siRNA）和siPKD2并轉染A549細胞和HeLa細胞，48小時后，分別在有無TNF-α作用下處理細胞12h，免疫熒光染色和共聚焦顯微鏡觀察表明，與對照組相比，經PPA轉染的siPKD2能夠明顯降低TNF-α介導的NF-κB p65核轉位。這些結果表明新合成的PPA不僅能夠有效地轉染質粒

17、到靶細胞中，而且也能夠與siRNA形成復合物，將siRNA有效導入靶細胞，并靶向敲低內源性靶基因的表達，從而有效降低下游信號分子的功能作用（入核）。
　　結論:
　　本研究中，我們研制開發(fā)出一種新型的陽離子聚合物-聚磷酰胺(PPA)。該陽離子聚合物在相對低的重量比的情況下可以有效地包裹DNA和siRNA。而且其具有較小尺寸的體積和較大的電動勢能。在不同的細胞中進行的細胞毒性測試和體外細胞轉染實驗表明，PPA不僅細胞毒性低而且