海藻酸微囊研制及其在肝組織工程中的應用.pdf

1、急性肝功能衰竭(ALF)作為一種臨床高發(fā)的嚴重肝病，病程發(fā)展快，死亡率極高。目前治療ALF最有效的方法是原位肝移植(orthotopic liver transplantation，OLT)，但是原位肝移植面臨的主要問題是供體缺乏，手術和治療費用高昂，而且需要終生服用免疫抑制劑等，使得臨床應用方面還存在一定局限性。有研究人員利用肝細胞移植來替代原位肝臟移植，在治療ALF上取得了一定進展，但肝細胞具有高度的環(huán)境依賴性，植入宿主體內(nèi)后因生存

2、環(huán)境的改變、免疫排斥反應等因素，活性迅速降低，導致治療效果并不理想。因此，迫切需要新的治療方法來提高ALF的治療效果。
　　 伴隨組織工程學的蓬勃發(fā)展，越來越多組織工程技術應用于肝臟疾病的治療，肝組織工程學應運而生。其最終目的是在體外經(jīng)過人工的方法培育成有正常代謝功能的肝組織或類器官，體內(nèi)移植后對肝功能受損患者的肝臟進行修補、恢復、重建直至完全替代。近年來，肝組織工程發(fā)展迅速，圍繞種子細胞種類、來源，細胞支架材料以及肝組織和器官

3、體外培養(yǎng)和構建體系--生物人工肝和生物反應器，國內(nèi)外研究人員展開了大量研究。
　　 肝組織工程學面臨的一大難題就是肝細胞來源的問題。自體肝細胞不宜大量體外擴增，外源性肝細胞雖然可以大量獲得，卻無法避免因宿主免疫排斥反應造成的破壞作用。細胞微囊化技術可對包裹其中的各種細胞進行有效保護，在一定程度上避免了細胞體內(nèi)移植后引發(fā)的免疫排斥反應；同時又可允許各類小分子營養(yǎng)物質(zhì)自由進出囊膜，支持細胞的正常增殖并維持其生理功能。這一技術有效擴展

4、了肝組織工程中可用的種子細胞范圍，使細胞的來源由自體肝細胞擴展到異體來源肝細胞。因此，以微囊化肝細胞為基礎的生物型人工肝研究目前已經(jīng)成為肝組織工程學的重要組成部分。
　　 海藻酸鈉-多聚賴氨酸-海藻酸鈉(alginate-Poly-L-lysine-alginate，A-PLL-A)微囊化制備技術是迄今為止研究最深入、應用最廣泛的微囊制備技術，被廣泛應用于各類細胞的包裹。在微囊化肝細胞研究領域，也取得了不少進展，尤其以在微囊化肝

5、細胞治療急性肝衰竭等方面。盡管如此，海藻酸微囊制備技術也存在著自身的局限和問題，主要體現(xiàn)在微囊的物理穩(wěn)定性和生物相容性不足等方面。而導致上述問題的主要原因是現(xiàn)有的微囊制備材料還未達到臨床上長期穩(wěn)定發(fā)揮治療功能的要求。因此，尋找和研制新型的微囊制備材料是微囊化人工細胞研究的主要研究方向和熱點之一。
　　 微囊制備材料是微囊化細胞性能優(yōu)劣的物質(zhì)基礎，研究人員通過提高海藻酸鹽純度、研究海藻酸化學構成對微囊性能的影響、尋找新型替代材料等

6、方法，以期得到物理性能、生物相容性等方面更好、更為穩(wěn)定可靠的微囊材料，并展開了大量研究。通過對海藻酸鹽進行純化的研究，發(fā)現(xiàn)高純的海藻酸鹽可有效提高微囊的生物相容性和機械強度；通過Ba2+替代Ca2+制備出的海藻酸鋇微囊(Ba-alginate-Poly-L-lysine-alginate，B-PLL-A)，有效提高了微囊的機械強度和物理穩(wěn)定性；通過對多聚賴氨酸(PLL)的研究，發(fā)現(xiàn)由于其與海藻酸的結合效率不足，可導致微囊膜粘附成纖維細胞

7、和巨噬細胞，產(chǎn)生多種細胞因子，從而降低微囊的長期穩(wěn)定性和生物相容性。因此，尋找PLL的替代材料也是一個研究熱點。
　　 多聚鳥氨酸(Poly-L-Ornithine，PLO)是一種表面帶有正電荷的氨基酸。近年來的研究表明，PLO與海藻酸鹽結合后，因兩者之間形成的化學鍵比較短，如用PLO取代PLL來制備微囊材料，可在一定程度上提高材料穩(wěn)定性。目前，相關研究尚處于起步階段，并主要集中于針對APA微囊改構，且僅有個別文獻報道了相應微囊

8、包裹成肌細胞的體外評價實驗。針對BPA等其它微囊，采用PLO取代PLL的研究，尚未見報道。
　　 本課題組前期已完成了以Ba2+替代Ca2+的制備海藻酸鋇-多聚賴氨酸-海藻酸鈉(Ba-alginate-Poly-L-lysine-alginate，B-PLL-A)微囊的研究，并對其物理性能和生物相容性進行了評價。在此基礎上，本研究以PLO替代PLL研制基于多聚鳥氨酸的兩種海藻酸微囊(APA、BPA微囊)，以探討PLO對海藻酸微囊

9、物理性能和生物相容性的影響。在體外，通過對人肝細胞系HL-7702進行微囊化培養(yǎng)，初步評價這兩種微囊滿足肝細胞增殖并維持其正常生理功能的效果；隨后，用多聚鳥氨酸的海藻酸微囊包裹小鼠肝細胞并植入到大鼠急性肝衰竭模型體內(nèi)，研究這種微囊化的肝細胞移植方法治療急性肝衰竭的效果，以期研制性能更為優(yōu)良的微囊材料。同時，為通過微囊化技術提高肝細胞移植治療肝臟疾病的效果提供實驗基礎。
　　 本論文主要包括以下四個部分內(nèi)容：
　　 第一部

10、分：基于多聚鳥氨酸的海藻酸微囊的研制及制備條件優(yōu)化
　　 作為一種新型微囊制備材料，PLO還未在本實驗室微囊制備平臺上有過任何使用經(jīng)驗，因此有必要對其制備條件進行摸索和優(yōu)化。本研究主要采用了以下手段對制備工藝進行探討：通過對微囊制備中微囊靜電發(fā)生儀電壓、注射泵速、注射針直徑、海藻酸鹽濃度、多聚氨基酸(PLL、PLO濃度和作用時間)等多項制備條件的改變，考察了上述條件的變化對所制微囊的影響，并優(yōu)化了的制備條件。
　　 本研

11、究研制出兩種基于PLO的新型海藻酸微囊：海藻酸鈉-多聚鳥氨酸-海藻酸(alginate-PLO-alginate，A-PLO-A)微囊和海藻酸鋇-多聚鳥氨酸-海藻酸(Ba-alginate-PLO-alginate，B-PLO-A)微囊。
　　 結果表明，優(yōu)化的A-PLO-A、B-PLO-A微囊制備條件是：靜電場為6～6.5kV/1.5cm，泵速度為15mL/h，針頭內(nèi)徑為0.25mm，海藻酸鈉濃度為2％，PLO濃度為0.05～

12、0.10％，作用時間8min，檸檬酸鈉液化時間8min，與傳統(tǒng)A-PLL-A、B-PLL-A優(yōu)化制備條件相比，靜電場電壓的允許范圍和多聚氨基酸的濃度范圍均有所放寬，有利于通過調(diào)整制囊條件，在不降低微囊質(zhì)量的情況下，控制微囊的大小。微囊制備條件的優(yōu)化為進一步評價其物理性能和生物形容性打下了基礎。
　　 第二部分：基于多聚鳥氨酸的海藻酸鋇微囊的物理與生物學性能評價
　　 本部分研究對B-PLO-A微囊與B-PLL-A微囊低滲

13、環(huán)境下穩(wěn)定性、機械強度以及通透性等物理性能進行了檢測，并對其生物學性能進行了評估。
　　 結果表明：B-PLO-A微囊較B-PLL-A微囊在低滲環(huán)境下更穩(wěn)定，不易形變破損；體外培養(yǎng)14天的B-PLO-A微囊較B-PLL-A微囊直徑增加的程度較小；機械振蕩96h后B-PLO-A微囊的完整率為99.3±1.0％，B-PLL-A微囊為96.24±1.5％，表明新型微囊在原有B-PLL-A微囊基礎上機械強度有了進一步提高。在微囊的通透性

14、方面，B-PLO-A微囊和B-PLL-A微囊均可以使4kD的小分子物質(zhì)自由擴散進入微囊內(nèi)部，70kDa的中等分子物質(zhì)可部分通過囊膜；而150 kDa的大分子物質(zhì)不易通過微囊膜，表明兩種類型的微囊膜均具備適宜的分子截留能力。腹腔移植8周后，從大鼠腹腔內(nèi)取出的B-PLO-A微囊與B-PLL-A微囊結構均較為完整，前者完整率為97.3％±2.1％，后者完整率為95.4%±2.4％，兩種微囊均呈圓球形，表面光滑，無細胞包裹，無明顯纖維化，說明B

15、-PLO-A微囊與B-PLL-A微囊均具備良好的生物相容性。目前國內(nèi)外尚未見相應研究報道。
　　 第三部分：基于多聚鳥氨酸的海藻酸微囊化人正常肝細胞系的體外培養(yǎng)
　　 本研究采用第一部分優(yōu)化的微囊制備條件，通過對A-PLO-A和B-PLO-A兩種微囊包裹的HL-7702細胞體外培養(yǎng)的形態(tài)觀察、代謝產(chǎn)物濃度水平的檢測，初步考察肝細胞在基于多聚鳥氨酸的微囊中生長增殖的情況，為進一步探討此兩種新型微囊用于微囊化肝細胞移植奠定了

16、基礎。
　　 結果表明：A-PLO-A和B-PLO-A兩種微囊包裹肝細胞后，體外培養(yǎng)1周，兩種微囊均可在微囊內(nèi)形成不同大小和形態(tài)的肝細胞聚集體，微囊內(nèi)細胞數(shù)量和體積均較包裹初期有所增長；移植4w后，回收微囊發(fā)現(xiàn)末出現(xiàn)明顯形變、細胞包繞和纖維化現(xiàn)象。兩種微囊化HL-7702細胞同樣具備持續(xù)合成白蛋白和尿素的能力，其濃度水平無統(tǒng)計學差異。表明微囊囊膜的存在并末對具有貼壁生長和接觸抑制性特征的HL-7702細胞的增殖和生理功能產(chǎn)生明顯

17、的不利影響。由此證明基于多聚鳥氨酸的新型海藻酸微囊在一定程度上可以滿足微囊化肝細胞生存的需要，并可維持其正常的生理功能?；赑LO的海藻酸微囊與肝細胞體外共培養(yǎng)研究目前國內(nèi)外尚未見報道。
　　 第四部分：基于多聚鳥氨酸的海藻酸微囊化肝細胞體內(nèi)移植治療肝衰的研究
　　 本研究主要探討A-PLO-A和B-PLO-A兩種新型微囊包裹小鼠肝細胞后，植入D-氨基半乳糖腹腔注射法制備的急性肝衰竭模型大鼠體內(nèi)，觀察大鼠死亡率、檢測微囊

18、內(nèi)肝細胞的生長、增殖、代謝的情況，以及能否有效改善肝衰大鼠的肝功能。主要實驗分組為A-PLO-A空微囊、B-PLO-A空微囊、移植游離的肝細胞、A-PLO-A微囊化肝細胞、B-PLO-A微囊化肝細胞五個組。
　　 研究結果表明，單純的空微囊對肝衰大鼠病情毫無緩解作用，移植后兩個空囊移植組3d死亡率均達到了100％。游離肝細胞組、A-PLO-A微囊化肝細胞組和B-PLO-A微囊化肝細胞組的大鼠ALT、AST、ALB水平均有所恢復，

19、4w時微囊移植組的上述指標均優(yōu)于游離肝細胞組，說明微囊化肝細胞移植有效緩解了肝臟損傷的程度，治療效果好于游離肝細胞組。微囊化肝細胞組大鼠的存活率明顯高于空囊移植組和游離肝細胞移植組；4周后回收的微囊表面光滑，無細胞包裹，無纖維化。表明基于多聚鳥氨酸的海藻酸微囊物理穩(wěn)定性和生物相容性良好，適合作為肝細胞體內(nèi)移植的載體。目前尚未見基于PLO的海藻酸微囊包裹肝細胞體外移植治療急性肝衰的研究報道。
　　 綜上所述，本研究首先成功制備了兩

20、種基于多聚鳥氨酸的新型微囊--A-PLO-A和B-PLO-A微囊，并對其制備條件進行了優(yōu)化，研究發(fā)現(xiàn)PLO對制備條件的變化敏感性弱于PLL，使其在更為寬泛的微囊靜電場壓下和多聚氨基酸濃度下能夠保持微囊質(zhì)量的穩(wěn)定，有利于通過制備條件的調(diào)節(jié)，到達不同制備條件的靈活配合，以獲得性能更為優(yōu)良的微囊；B-PLO-A在物理穩(wěn)定性和機械性能方面較B-PLL-A微囊有進一步提高，且具備了適宜的分子截留能力，生物相容性良好；體外培養(yǎng)A-PLO-A和B-P