甘肅和四川省牦牛奶制品中乳酸菌的多樣性研究.pdf

1、本研究從我國甘肅省和四川省6個縣27個地區(qū)的不同牧民家庭采集牦牛奶及傳統(tǒng)發(fā)酵牦牛奶制品（酸牦牛奶、曲拉、乳清和酥油）共152份，對其中蘊含的乳酸菌采用傳統(tǒng)純培養(yǎng)方法進行了分離，利用16S rDNA序列分析等方法對分離株進行了鑒定并分析了其中的乳酸菌多樣性；選取有代表性的傳統(tǒng)發(fā)酵牦牛奶制品樣品，采用非培養(yǎng)的宏基因組學(xué)方法（PCR-DGGE和焦磷酸測序）對其中的微生物多樣性進行了進一步的研究分析。結(jié)論如下：
　　1.采用BCP平板計數(shù)

2、法檢測了所有樣品中乳酸菌活菌總數(shù)，結(jié)果顯示乳酸菌活菌數(shù)變化范圍在4.00 lg cfu/mL～9.15 lg cfu/mL，且大多數(shù)樣品乳酸菌數(shù)在6.00 lg cfu/mL以上。同時采用選擇性培養(yǎng)基（MRS和M17）并結(jié)合形態(tài)觀察對樣品中的乳酸菌進行了分離，獲得乳酸菌分離株533株。
　　2.通過形態(tài)觀察和16S rDNA序列分析法對所有的乳酸菌分離株進行了鑒定，對16S rDNA序列相似性高的菌株采用種特異性PCR、PCR-R

3、FLP、DGGE等技術(shù)進行了鑒定，最終將所有分離的乳酸菌鑒定到種或亞種水平，建立了鑒定乳酸菌的分子生物學(xué)平臺。533株乳酸菌分離株屬于6個屬24個不同的種和亞種，其中乳桿菌屬（Lactobacillus）246株，占分離乳酸菌總數(shù)46.15％；其次為明串珠菌屬（Leuconostoc）156株，占29.27%；鏈球菌屬（Streptococcus）67株，占12.57%；乳球菌屬（Lactococcus）50株，占9.38%；腸球菌屬（

4、Enterococcus）11株，占2.64%；魏斯氏菌屬（Weissella）3株，占0.56%；在微生物的多樣性上，瑞士乳桿菌（24.2%）和腸膜明串珠菌腸膜亞種（20.64%）是甘肅和四川牦牛奶及傳統(tǒng)發(fā)酵牦牛奶制品中的優(yōu)勢菌種。不同地區(qū)不同種類的牦牛奶制品中乳酸菌組成既有相似性也有差別，如：瑞士乳桿菌是甘肅地區(qū)的傳統(tǒng)發(fā)酵酸牦牛奶、曲拉、乳清中的優(yōu)勢菌；而嗜熱鏈球菌和瑞士乳桿菌分別是四川酸牦牛奶和曲拉的優(yōu)勢乳酸菌。
　　3.建

5、立了甘肅和四川地區(qū)牦牛奶制品中乳酸菌的16S rDNA基因序列數(shù)據(jù)庫，將分離得到的533株乳酸菌的16S rDNA序列全部上傳到GenBank數(shù)據(jù)庫，登錄號為HM058517-HM058580，HM058582-HM0059029，HM217942-HM217944，HM217948，HM217953，HM217956，HM217962，HM217964，HM217967，HM217971-HM217975，M217984-HM2179

6、86，HM217994-HM217999。
　　4.采用非培養(yǎng)的PCR-DGGE技術(shù)分析研究了四川有代表性的10份曲拉中的微生物多樣性。結(jié)果顯示曲拉樣本中包含了9種以上乳酸菌（Lb. helveticus，Lb. plantarum，Lb. fermentum，Lb. paralimentarius，Lb. sanfranciscensis，Leu. citreum，Lb. curvatus，E. durans，Lac. lact

7、is）。
　　5.利用高通量的454焦磷酸測序技術(shù)分析了甘肅和四川有代表性的酸牦牛奶樣本中微生物多樣性。結(jié)果顯示酸牦牛奶中包含了多種復(fù)雜微生物，根據(jù)16S rDNA序列比對后所有細菌被劃分到Firmicutes（厚壁菌門）、Actinobacteria（放線菌門）、Bacteroidetes（擬桿菌門），Deinococcus-Thermus（異常球菌-棲熱菌門），Proteobacteria（變形菌門）和未知的Environme

8、ntal samples（環(huán)境樣本）等6門37屬；Firmicutes的乳酸菌（Lactobacillus，Streptococcus，Lactococcus，Leuconostoc）在酸牦牛奶樣本中占比例最高；且甘肅和四川地區(qū)牦牛奶樣本中細菌主成分具有明顯的地域差異。這些大量的數(shù)據(jù)讓我們對酸牦牛奶中微生物的菌群結(jié)構(gòu)有了全新的認識。
　　6.純培養(yǎng)方法與宏基因組學(xué)方法均證實傳統(tǒng)發(fā)酵牦牛奶制品中微生物種類豐富多樣，而且乳酸菌是優(yōu)勢菌

9、，其中乳桿菌最多。所采用的三種分析多樣性的方法各具優(yōu)勢，純培養(yǎng)方法只能分析到可培養(yǎng)菌，優(yōu)點是獲得的純培養(yǎng)菌株可以用于下步發(fā)酵劑的篩選；PCR-DGGE和焦磷酸測序技術(shù)都能基于宏基因組學(xué)水平揭示菌群結(jié)構(gòu)的。DGGE直觀快速地反映出樣品中優(yōu)勢菌群的構(gòu)成；通過最新的焦磷酸測序技術(shù)得到的OUT數(shù)比PCR-DGGE多，更全面的反映出菌群的組成和豐度。
　　本文系統(tǒng)地研究了中國甘肅和四川地區(qū)牦牛奶及各種傳統(tǒng)發(fā)酵牦牛奶制品中乳酸菌的組成，這為益