Bacillus smithii產(chǎn)耐熱菊粉酶的分離純化及其化學(xué)修飾.pdf

1、本文對(duì)實(shí)驗(yàn)室篩選的兩株高產(chǎn)耐熱菊粉酶的Bacillus smithii菌株，優(yōu)化條件下進(jìn)行產(chǎn)酶發(fā)酵，分離純化得到耐熱菊粉酶，研究其酶學(xué)性質(zhì)，應(yīng)用化學(xué)修飾的方法表征影響耐熱菊粉酶活性的關(guān)鍵氨基酸組成，探討其催化作用機(jī)理和耐熱機(jī)制。 優(yōu)化培養(yǎng)Bacillus smithii T4，離心收集發(fā)酵上清液，通過(guò)硫酸銨分級(jí)沉淀、透析脫鹽、Sepharose Q-FF、DEAE-Sepharose CL-6B離子交換層析和Superdex75

2、凝膠過(guò)濾層析得到純化的菊粉酶，SDS-PAGE檢測(cè)為單一條帶，亞基分子量約為45.5KD，比酶活為881.6 IU/mg。酶學(xué)性質(zhì)研究表明：該酶催化作用的最適溫度為60℃，60℃和70℃的半衰期分別為8h和5h；最適pH為5.0，在pH4.5-7穩(wěn)定性較好；以菊粉為底物時(shí)，米氏常數(shù)Km值為2.73mmol/L，沒(méi)有轉(zhuǎn)化酶活性，表明來(lái)源Bacillus smithii T4菊粉酶的底物專一性較好。而來(lái)源于Bacillus smithii

3、T7耐熱菊粉酶，比來(lái)源于Bacillus smithii T4菊粉酶催化效率高，比酶活可達(dá)1283.9 IU/mg，而且耐熱性能更好。 采用化學(xué)修飾法研究Bacillus smithii T7產(chǎn)耐熱菊粉酶的酶活中心氨基酸組成：發(fā)現(xiàn)PMSF(苯甲基磺酰氟)、2，3-丁二酮、NAI(N-乙?；溥?、IAA(碘代乙酸)、DTT(二硫蘇糖醇)修飾對(duì)菊粉酶活力影響不大，說(shuō)明絲氨酸、精氨酸、酪氨酸以及賴氨酸均不是酶催化反應(yīng)所必需氨基酸，且

4、酶活中心不存在二硫鍵；DEPC(焦碳酸二乙酯)和EDCI(碳二亞胺鹽酸鹽)修飾菊粉酶的結(jié)果表明：菊粉酶的催化活性中心存在一個(gè)組氨酸殘基和一個(gè)谷氨酸(天冬氨酸)殘基，且組氨酸殘基參與了菊粉酶的底物結(jié)合過(guò)程，而谷氨酸(天冬氨酸)殘基只參與催化水解過(guò)程，推測(cè)Bacillus smithii T7產(chǎn)耐熱菊粉酶的催化機(jī)理是經(jīng)典酸堿催化機(jī)制；利用NBS(N-溴代琥珀酰亞胺)修飾菊粉酶及Tsou's plot分析，發(fā)現(xiàn)菊粉酶中有兩個(gè)色氨酸殘基為酶活性