二級(jí)三維多孔天然膠原-羥基磷灰石骨組織工程復(fù)合支架材料的體外構(gòu)建及其生物性能研究.pdf

1、由交通事故、建筑事故、工傷、腫瘤及各種疾病導(dǎo)致的骨缺損病人數(shù)量日益增加。目前，最常應(yīng)用的自體移植雖能較快的修復(fù)骨缺損，但自然資源相當(dāng)有限；作為外科骨重建基本方法的脫鈣骨基質(zhì)缺乏自體骨所具有的生物活性，而且可能會(huì)有攜帶疾病的危險(xiǎn)并有免疫排斥反應(yīng)。傳統(tǒng)的生物材料，包括生物陶瓷、玻璃、金屬和高分子材料，因?yàn)椴痪哂猩锘钚裕瑢?duì)骨組織進(jìn)行修復(fù)之后，會(huì)產(chǎn)生許多固有的問(wèn)題，如結(jié)合差、磨損、腐蝕，特別是無(wú)法形成“活”的具有生物功能的骨組織，難以從根本上

2、解決患者的痛苦和實(shí)現(xiàn)缺損部位的功能。組織工程為骨缺損修復(fù)提供了一種最佳的解決方案。
　　 國(guó)內(nèi)外生物材料科學(xué)工作者在骨組織工程支架材料方面進(jìn)行了大量的研究工作，也取得了一定的研究成果，并且某些產(chǎn)品已經(jīng)應(yīng)用于臨床，但目前仍存在大量問(wèn)題，陶瓷材料難以降解，聚乳酸(PLA)和聚乳酸-羥基乙酸共聚物(PLGA)降解產(chǎn)物為酸性，不利于新組織的生長(zhǎng)。膠原蛋白-羥基磷灰石納米晶復(fù)合支架材料具有良好的生物相容性和骨組織修復(fù)能力，可以真正實(shí)現(xiàn)“骨

3、組織體內(nèi)重建”，是一種有應(yīng)用前景的骨組織工程支架材料。然而，高質(zhì)量的膠原蛋白提純成本高，并且需要去除末端肽以降低抗其原性，所以?xún)r(jià)格昂貴，這是材料難以推廣應(yīng)用的原因之一。此外，傳統(tǒng)膠原海綿支架是將膠原溶解，通過(guò)戊二醛等交聯(lián)劑進(jìn)行交聯(lián)重建得到的，而戊二醛會(huì)隨著膠原支架在體內(nèi)降解后釋放，這可能會(huì)對(duì)機(jī)體產(chǎn)生毒性；高分子及其復(fù)合支架材料的初始強(qiáng)度都較低。因此，目前世界范圍內(nèi)迫切需要成本較低、生物活性高、可實(shí)現(xiàn)體內(nèi)骨組織重建和初始強(qiáng)度高的高性能骨組

4、織工程支架材料。
　　 豬皮脫細(xì)胞真皮基質(zhì)(PADM)已經(jīng)作為皮膚修復(fù)材料用于燒傷和其它皮膚缺損的治療，由于其良好的降解特性，天然的網(wǎng)絡(luò)結(jié)構(gòu)和優(yōu)異的生物相容性和生物活性，取得了很好的治療效果。而且PADM主要由I型膠原組成，與骨組織主要有機(jī)組成相似。本研究以PADM為有機(jī)基質(zhì)，納米羥基磷灰石為無(wú)機(jī)組成，通過(guò)仿生礦化法制備了具有二級(jí)三維多孔結(jié)構(gòu)，價(jià)格低廉，力學(xué)強(qiáng)度高，易于立體裁剪，可控生物降解，生物相容性好的PADM-羥基磷灰石(

5、PADM-HAp)骨組織工程復(fù)合支架材料，并研究了其生物活性。
　　 本論文主要包括以下幾個(gè)方面的工作：
　　 1.豬脫細(xì)胞真皮基質(zhì)的提取及表征:綜合堿處理、酶處理、表面活性劑(SDS)處理和鹽處理四種制備脫細(xì)胞真皮基質(zhì)方法的優(yōu)點(diǎn)，探索出了新的PADM制備工藝。蘇木精-伊紅(H&E)染色和掃描電鏡(SEM)分析都表明采用本方法制備的支架材料中沒(méi)有細(xì)胞殘余，膠原的天然結(jié)構(gòu)被完整保存。支架的連通孔結(jié)構(gòu)及孔徑大小隨pH值改變而

6、變化，傅里葉變換紅外光譜(FTIR)結(jié)果表明PADM與市售的Sigma公司的高純膠原的圖譜一致。總氨基酸含量分析表明，隨著酶濃度的增加，所制備的PADM支架中總氨基酸含量逐漸降低。隨著酶濃度的增加及處理時(shí)間的增長(zhǎng)，羥脯氨酸的含量升高，極限拉伸強(qiáng)度降低，PADM體外降解速率加快。
　　 2.二級(jí)三維多孔結(jié)構(gòu)PADM-HAp復(fù)合支架的體外構(gòu)建及表征:豬脫細(xì)胞真皮基質(zhì)為軟組織來(lái)源，而且在提取過(guò)程中，天然膠原結(jié)構(gòu)被完整保存，膠原分子中氨

7、基酸殘基較少，因此原膠原分子表面有利于無(wú)機(jī)納米羥基磷灰石(HAp)成核的活性位點(diǎn)變少?；诖耍狙芯刻岢隽藘刹降V化法，即預(yù)鈣化和模擬體液中(SBF)中仿生礦化。預(yù)鈣化過(guò)程對(duì)促進(jìn)HAp在PADM支架中快速成核生長(zhǎng)起到重要作用，而在SBF中仿生礦化過(guò)程有利于HAp納米網(wǎng)絡(luò)結(jié)構(gòu)的形成。通過(guò)兩步礦化過(guò)程將HAp納米結(jié)構(gòu)組裝到PADM中，構(gòu)建了具有二級(jí)三維網(wǎng)絡(luò)結(jié)構(gòu)的HAp-PADM支架。在SBF中礦化15天后的HAp-PADM支架，不僅保存了來(lái)源

8、于天然PADM的大孔(>100μm)，而且在大孔的孔壁表面自組裝形成HAp納米結(jié)構(gòu)網(wǎng)絡(luò)(<100nm)。對(duì)于干燥狀態(tài)的PADM及在SBF中礦化不同時(shí)間的PADM進(jìn)行機(jī)械性能分析，結(jié)果表明干支架的抗壓彈性模量隨著HAp含量的增加而增大。十五天礦化后得到的PADM-HAp復(fù)合支架(S15D)經(jīng)過(guò)磷酸鹽緩沖溶液(PBS，pH=7.4)浸濕12小時(shí)后支架的壓縮彈性模量高達(dá)600 kPa，是傳統(tǒng)方法制備的HAp-膠原海綿材料的上百倍。激光共聚焦顯

9、微鏡(CLSM)觀察和細(xì)胞毒性實(shí)驗(yàn)(MTT)結(jié)果顯示MC3T3-E1細(xì)胞在純PADM和S15D支架上有相似的細(xì)胞形貌和增殖行為，表明S15D有較高的機(jī)械強(qiáng)度和良好的細(xì)胞相容性。
　　 3.二級(jí)三維PADM-HAp網(wǎng)絡(luò)結(jié)構(gòu)形成機(jī)理研究:對(duì)兩步礦化過(guò)程中片狀羥基磷灰石在PADM中的形成過(guò)程進(jìn)行了研究。FTIR和能譜分析(EDS)結(jié)果表明在預(yù)鈣化過(guò)程中有Ca2+和HPO42-被PADM支架所吸附，但它們并沒(méi)有直接沉淀形成磷酸鈣晶體，而

10、是以離子的形式吸附在膠原分子表面。SEM觀察結(jié)果顯示礦化八天后有片狀HAp晶體在PADM表面形成，高分辨電子顯微鏡(HRTEM)及電子衍射結(jié)果表明片狀HAp晶體沿c-軸在PADM孔道表面生長(zhǎng)。FTIR和熱重/差熱綜合熱分析(TG-DTA)證明該過(guò)程形成的羥基磷灰石為含碳酸鹽磷灰石。本文在分子水平上對(duì)兩步礦化過(guò)程進(jìn)行了初步模擬，借助雙電層(EDL)理論解釋了預(yù)鈣化過(guò)程中HPO42-和Ca2+在膠原表面的吸附能夠促進(jìn)羥基磷灰石在PADM中快

11、速形成。
　　 4.PADM-HAp復(fù)合支架的蛋白吸附性能研究及其對(duì)細(xì)胞活性的影響:通過(guò)兩步礦化法，改變生物礦化時(shí)間，制備出兩種PADM-HAp[十天礦化PADM(S10D)，十五天礦化PADM(S15D)]復(fù)合支架，通過(guò)測(cè)量計(jì)算得PADM、S10D和S15D的孔隙率分別為87.5％、87.5％和80％。纖維蛋白原和白蛋白吸附實(shí)驗(yàn)表明PADM比S10D和S15D有更高的蛋白吸附能力，在4-12小時(shí)內(nèi)蛋白吸附達(dá)到最大量。支架的蛋白

12、吸附和脫附性能明顯影響了MC3T3-E1細(xì)胞在支架上及支架周?chē)幕钚?。?duì)三種支架進(jìn)行培養(yǎng)基預(yù)吸附，培養(yǎng)48天后，種植在PADM及S10D支架上的細(xì)胞表現(xiàn)出明顯的增殖，而S15D支架上的細(xì)胞卻因胎牛血清(FBS)濃度過(guò)底而沒(méi)有增殖現(xiàn)象。結(jié)果表明，羥基磷灰石在支架中的含量增加減弱支架的FBS吸附能力。
　　 5.HAp-PADM的生物相容性及生物活性研究:將不同礦化時(shí)間的支架材料移植到大鼠肌肉中進(jìn)行體內(nèi)生物相容性分析。H&E染色結(jié)果

13、表明PADM、S10D和S15D都有良好的體內(nèi)生物相容性。肌肉種植30天后，支架中都有不同程度的成血管現(xiàn)象，60天后，血管現(xiàn)象明顯。羥基磷灰石在支架中含量越多，支架的降解速率越慢，體內(nèi)種植60天后，PADM被完全降解掉，S10D被大部分降解，S15D中因含有較多納米羥基磷灰石而在120天后才明顯降解。支架材料移植到大鼠體內(nèi)后，材料及降解產(chǎn)物都沒(méi)有明顯的免疫排斥反應(yīng)。將PADM及S15D移植到大鼠下頜骨4mm臨界骨缺損處，15周后取出下頜