N-異丙基丙烯酰胺類溫敏型聚合物的制備及其協(xié)助蛋白質(zhì)體外復性研究.pdf

1、浙江大學化學工程與生物工程學系博士學位論文N異丙基丙烯酰胺類溫敏型聚合物的制備及其協(xié)助蛋白質(zhì)體外復性研究姓名：葛翔申請學位級別：博士專業(yè)：生物化工指導教師：姚善涇關(guān)怡新20090401浙江大學博士學位論文摘要利用6次后溶菌酶的活力回收率仍分別高出稀釋復性15％和12％以上。兩種凝膠協(xié)助復性和稀釋復性的時間基本相同，凝膠的加入并沒有成為復性的限速步驟。線性聚合物的合成，性能表征及其協(xié)助溶菌酶體外復性效果的考察：采用自由基聚合法，以偶氮二異

2、丁腈(AIBN)為引發(fā)劑，N異丙基丙烯酰胺(NIPA)為單體，在乙醇溶液中合成了PNIPAAm。溫敏性能研究表明，其低臨界溶解溫度(LCST)約為32℃，該值受PNIPAAm基團的親水疏水相互作用強弱變化的控制，隨PNIPAAm分子量、溶液濃度和溶液組成不同而略有變化。PNIPAAm凝膠具有較好協(xié)助溶菌酶復性的效果，與稀釋復性相比，PNIPAAm可大大提高蛋白復性的初始濃度，在協(xié)助蛋白質(zhì)復性上有較大優(yōu)勢。當溶菌酶濃度為60099／ml時

3、，活性回收率從稀釋復性的1193％提高到7983％，改進非常明顯。系統(tǒng)考察了復性液中PNIPAAm與溶菌酶濃度比(w／w)、尿素濃度和復性溫度對溶菌酶復性效果的影響，確定本實驗中合適的復性條件為，PNIPAAm與溶菌酶濃度比8、尿素濃度18mol／L、復性溫度30“C。接枝型聚合物PSgraftedPNIPAAm微球的制備、性能表征及其協(xié)助溶菌酶體外復性效果的考察：采用無皂乳液聚合法和紫外光引發(fā)表面接枝技術(shù)制備了PSgraftedPNI

4、PAAm微球，獲得了ParticleA(PS核心直徑442nm，PNIPAAm高分子毛發(fā)層厚度122nm)和ParticleB(PS核心直徑442nm，PNIPAAm高分子毛發(fā)層厚度89nm)兩種微球。微球形貌為圓球形，且粒徑分布較為均一，單分散性良好，尺寸為亞微米級，其LCST均在34。C左右。將PSgraftedPNIPAAm微球應用于溶菌酶的體外復性中，優(yōu)化的復性工藝條件為：復性溫度30。C，復性液中尿素濃度3mol／L，GSH與

5、GSSG的濃度比8：1(其中GSSG的濃度0375mmoFL)，ParticleA和ParticleB與溶菌酶的濃度比分別為O5和10。在優(yōu)化的復性條件下，ParticleA和ParticleB的加入可以在較高蛋白濃度條件下顯著地提高其活性收率，當溶菌酶的濃度為50099／nd時，ParticleA和ParticleB的加入使得復性后的活性回收率分別達到了715％和580％，比稀釋復性的收率提高了367和232個百分點，從而極大地降低了