木糖產(chǎn)乙醇酵母的篩選及分子生物學(xué)改造.pdf

1、隨著能源危機(jī)的日益加劇，化石燃料日益減少，國(guó)際原油價(jià)格不斷上漲。以纖維質(zhì)原料生產(chǎn)燃料乙醇是目前國(guó)內(nèi)外的研究熱點(diǎn)之一。其研究關(guān)鍵之一就是選育一株能有效利用各種糖底物，且高效產(chǎn)生乙醇的微生物菌種。本論文以此為研究點(diǎn)，采用代謝工程育種策略，以篩選得到的野生型熱帶假絲酵母為研究對(duì)象，通過(guò)改變其代謝流來(lái)達(dá)到提高乙醇產(chǎn)量的目的。 從256個(gè)自然樣品中篩選得到1株可高效轉(zhuǎn)化D—木糖的酵母441-28-1。根據(jù)常規(guī)形態(tài)鑒別，生理生化實(shí)驗(yàn)測(cè)定，以

2、及ITs區(qū)域核酸序列同源性比較分析，證實(shí)該菌株屬于Candidatropicalis(熱帶假絲酵母)，其ITS序列在GenBank的登記號(hào)為EU121523，Candidatropicalis(熱帶假絲酵母)已保存于中國(guó)高校工業(yè)微生物資源數(shù)據(jù)平臺(tái)，保藏編號(hào)為CICIMY0092。 以篩選出來(lái)的熱帶假絲酵母為研究對(duì)象，通過(guò)代謝產(chǎn)物分析發(fā)現(xiàn)該酵母木糖代謝的主要產(chǎn)物為木糖醇，葡萄糖代謝的主要產(chǎn)物為乙醇。通過(guò)分析酵母的代謝途徑并測(cè)定木糖

3、代謝途徑中的兩個(gè)關(guān)鍵酶的比酶活力后，并結(jié)合文獻(xiàn)報(bào)道，確定了代謝工程育種策略為：通過(guò)增加細(xì)胞內(nèi)木糖醇脫氫酶的表達(dá)量，來(lái)減少木糖醇的積累，試圖將代謝流引向乙醇形成方向，以達(dá)到提高乙醇產(chǎn)量的目的。 以本實(shí)驗(yàn)室先期構(gòu)建的pXY212-XYL2質(zhì)粒為基礎(chǔ)載體，構(gòu)建了含有潮霉素抗性的質(zhì)粒pYX212-XYL2-hygro(該質(zhì)粒用于整合表達(dá)時(shí)，需先用限制性?xún)?nèi)切酶NotI先將其線性化)，電擊轉(zhuǎn)化進(jìn)入酵母，潮霉素抗性平板上篩選得到轉(zhuǎn)化子。提取整

4、合表達(dá)的重組菌染色體進(jìn)行PCR驗(yàn)證，得到1.7kb的樹(shù)干畢赤酵母XYL2基因，說(shuō)明該基因已整合到酵母染色體上。酶活測(cè)定后，發(fā)現(xiàn)游離表達(dá)的重組菌的比酶活力達(dá)到0.5u/mg，比原始菌株提高了3倍；而整合表達(dá)的重組菌的比酶活力僅提高了15％，提高幅度有限。 木糖發(fā)酵實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，游離表達(dá)的重組菌株與原始菌株相比，木糖醇得率降低了3倍，乙醇得率提高了5倍；整合表達(dá)的重組菌株與原始菌株相比，乙醇得率沒(méi)有發(fā)生明顯的變化，但木糖醇積累量有所降低