雷帕霉素高產(chǎn)菌株選育及代謝輪廓分析指導(dǎo)發(fā)酵優(yōu)化.pdf

1、雷帕霉素(Rapamycin)是由吸水鏈霉菌發(fā)酵生產(chǎn)的一種大環(huán)內(nèi)酯類化合物,它具有抗真菌、免疫抑制、抗腫瘤、神經(jīng)保護(hù)和抗衰老等活性,臨床上被應(yīng)用于器官移植的抗排斥反應(yīng)和自身免疫性疾病的治療。選育雷帕霉素高產(chǎn)菌株并對(duì)其發(fā)酵工藝優(yōu)化,提高雷帕霉素發(fā)酵水平,對(duì)于雷帕霉素工業(yè)化及其生產(chǎn)成本的降低具有重要的意義。
　　1.紫外線誘變法是野生型微生物誘變育種中最常用、比較有效的誘變方法之一。本文首先以野生型Streptomyces hygro

2、scopicus ATCC 29253為出發(fā)菌株,對(duì)其進(jìn)行紫外誘變,篩選到一株遺傳穩(wěn)定、產(chǎn)量為153mg/L的高產(chǎn)菌株(S.hygroscopicus U1-6E7),與出發(fā)菌株發(fā)酵單位(76mg/L)相比,雷帕霉素產(chǎn)量被提高了109.2％。對(duì)突變株發(fā)酵條件進(jìn)行優(yōu)化后,雷帕霉素產(chǎn)量被提高至196mg/L。由于碩士研究時(shí)間限制,本論文以S.hygroscopicus U1-6E7為出發(fā)菌株同時(shí)開展了代謝輪廓分析指導(dǎo)發(fā)酵培養(yǎng)基優(yōu)化和賴氨酸耐

3、受菌株篩選。
　　2.利用代謝輪廓分析方法,研究菌株U1-6E7在不同培養(yǎng)條件下胞內(nèi)代謝輪廓特征。偏最小二乘法(PLS)分析結(jié)果表明菌體初級(jí)代謝和雷帕霉素產(chǎn)量具有很強(qiáng)相關(guān)性,鑒定出16種關(guān)鍵化合物。關(guān)鍵化合物變化結(jié)合相關(guān)途徑分析,理性提出培養(yǎng)基動(dòng)態(tài)添加策略,即在發(fā)酵的0h和12h分別添加1.0g/L油酸甲酯和0.5g/L賴氨酸,24h添加0.5g/L莽草酸,36h添加0.5g/L琥珀酸鈉、0.1g/L色氨酸、0.1g/L酪氨酸和0

4、.1g/L苯丙氨酸。采取理性添加策略后,雷帕霉素產(chǎn)量提高至307mg/L,與動(dòng)態(tài)添加之前雷帕霉素產(chǎn)量(196mg/L)相比,提高了56.6%。這些結(jié)果表明代謝物輪廓分析方法理性指導(dǎo)發(fā)酵培養(yǎng)基優(yōu)化能夠成功地用于提高抗生素發(fā)酵水平,為發(fā)酵培養(yǎng)基優(yōu)化提供了新的方向。
　　3.賴氨酸促進(jìn)雷帕霉素合成,但菌株U1-6E7對(duì)賴氨酸極為敏感。以U1-6E7為出發(fā)菌株,通過紫外誘變和賴氨酸耐受篩選,獲得一株賴氨酸耐受菌株,與U1-6E7相比,其對(duì)