醋酸高產(chǎn)菌株選育及其代謝調(diào)控研究.pdf

1、醋酸是食醋的主要成分，廣泛用于醋酸纖維、醋酐、醋酸乙烯、金屬醋酸鹽等化工業(yè)，在食品工業(yè)中用作酸化劑、增香劑和香料等。醋酸生產(chǎn)方法很多，但用于食品行業(yè)的醋酸只能使用生物法生產(chǎn)。巴氏醋酸菌(Acetobacter pasteurianus)一直是中國食醋發(fā)酵的主要菌種，但是該菌種涉及具體菌株多，產(chǎn)酸能力強的優(yōu)勢菌株極少，且菌株性能不穩(wěn)定。為提高醋酸發(fā)酵能力，獲得優(yōu)勢菌株，本研究從幾株常用醋酸菌中選出了一株生長狀況較好且產(chǎn)酸強度高的菌株（Ac

2、etobacter pasteurianus BJST-S）;對該菌株進行紫外誘變，選育出一株優(yōu)良醋酸菌YHL3;結(jié)合其發(fā)酵特性及代謝通量分析，探討其誘變機制;對其進行關(guān)鍵酶活代謝調(diào)控;并優(yōu)化醋酸菌YHL3半連續(xù)罐發(fā)酵工藝參數(shù)，建立了高濃度醋酸發(fā)酵體系。主要研究結(jié)果如下:
　　(1)優(yōu)良醋酸菌的選育。通過對比三個菌株的發(fā)酵特性，確定了巴氏醋桿菌BJST-S為優(yōu)勢菌株，其最高產(chǎn)總酸量為60.15g/L;并對其進行誘變選育、高醇壓力培

3、養(yǎng)，選出在高醇壓力下總酸產(chǎn)量最高（42.55±0.86g/L）的菌株，命名為Acetobacter pasteurianus YHL3;利用該菌株，進行5次傳代培養(yǎng)和發(fā)酵實驗，每批發(fā)酵48h，產(chǎn)酸量維持在58.10～59.68g/L，發(fā)酵強度維持在1.21～1.24g/(L·h)。
　　(2)誘變機理研究。對醋酸菌YHL3與BJST-S進行耐受性對比試驗結(jié)果表明，在高醇下，YHL3的乙醇脫氫酶(ADH)和乙醛脫氫酶(ALDH)比酶

4、活最大值分別為5.96±0.26U/mg和4.82±0.22U/mg均高于BJST-S的ADH和ALDH比酶活(分別為4.78±0.28U/mg和4.12±0.24U/mg);在底酸下，YHL3的ADH和ALDH比酶活最大值分別為6.08±0.18U/mg和5.47±0.16U/mg均高于BJST-S的ADH和ALDH比酶活（分別為5.66±0.16U/mg和4.87±0.12U/mg）;采用SDS-PAGE凝膠電泳對比分析的ADH酶蛋

5、白表達與酶活性測定結(jié)果一致;結(jié)合文獻構(gòu)建了巴氏醋桿菌的代謝網(wǎng)絡(luò)途徑，列出了47個代謝通量方程式，對比BJST-S與YHL3內(nèi)部代謝速率情況發(fā)現(xiàn)YHL3的乙醇氧化呼吸鏈途徑的酶系優(yōu)于BJST-S。
　　(3)代謝調(diào)控研究。采用單因素和響應(yīng)面試驗優(yōu)化法獲得YHL3的種子培養(yǎng)基成分為:無水乙醇2.4％(V/V)，葡萄糖為10.7(g/L)，酵母膏為10g/L，MgSO4為1.2(g/L)，K2HPO4為3.4(g/L)，此條件下乙酸產(chǎn)量

6、可達54.75±0.72g/L;研究4種金屬離子對醋酸菌代謝過程中關(guān)鍵酶活性影響，確定了Mg2+可作為金屬離子激活劑，發(fā)酵72h，加入MgSO4的發(fā)酵培養(yǎng)基中生物量為2.12±0.16g/L，乙酸產(chǎn)量為56.84±1.42g/L。
　　(4)半連續(xù)醋酸發(fā)酵體系的構(gòu)建。優(yōu)化的搖瓶補料分批發(fā)酵培養(yǎng)基為，葡萄糖為10g/L，酵母膏為8g/L，乙醇為5％(v/v)，金屬Mg2+離子為10mmol/L。在此較優(yōu)條件下，搖瓶補料分批發(fā)酵進行四