基于脫氧核酶的金屬離子傳感器及基于上轉(zhuǎn)換發(fā)光納米晶體的生物傳感器設(shè)計(jì).pdf

1、本論文的工作分為脫氧核酶型重金屬離子傳感器的設(shè)計(jì)和稀土上轉(zhuǎn)換發(fā)光材料的合成及其生物檢測(cè)應(yīng)用兩個(gè)部分。
　?、衩撗鹾嗣冈谥亟饘匐x子傳感器方面的應(yīng)用。
　　脫氧核酶是通過體外篩選技術(shù)得到的具有酶活性的小分子單鏈DNA，與天然酶相比，脫氧核酶具有穩(wěn)定、價(jià)廉、易于合成和修飾及易于儲(chǔ)存等特點(diǎn)，而且脫氧核酶對(duì)特定的金屬離子顯示了高度的特異性識(shí)別，其酶活性與特定金屬離子的濃度密切相關(guān)，這些特點(diǎn)使其在金屬離子檢測(cè)中的應(yīng)用備受關(guān)注。
　

2、　(1)本章中將Pb2+DNAzyme中所使用的底物鏈與酶鏈用兩個(gè)胞嘧啶堿基(C)進(jìn)行連接，成為一條寡核苷酸鏈，并在其5’-端和3’-端分別標(biāo)記以熒光基團(tuán)和猝滅基團(tuán)。在該寡核苷酸鏈形成的分子內(nèi)二倍體結(jié)構(gòu)當(dāng)中，熒光基團(tuán)與猝滅基團(tuán)緊密接觸，從而保證了高熒光猝滅效率，極大地降低了檢測(cè)體系的背景信號(hào)，提高了信噪比。同時(shí)該檢測(cè)體系可以對(duì)pb2+的加入作出快速響應(yīng)，在30秒內(nèi)檢測(cè)體系的熒光信號(hào)即可達(dá)到穩(wěn)定，從而可以實(shí)現(xiàn)Pb2+的快速檢測(cè)。利用該方法

3、進(jìn)行Pb2+的定量檢測(cè)，檢測(cè)限可以達(dá)到3.1nM，遠(yuǎn)遠(yuǎn)低于歐盟對(duì)于飲用水中Pb2+的濃度要求(72 nM)。在這一方法中，單一寡核苷酸探針鏈形成的分子內(nèi)二倍體結(jié)構(gòu)不僅保證了檢測(cè)體系具有較低的背景熒光，其良好的穩(wěn)定性也極大地增加了該傳感器對(duì)溫度變化及離子強(qiáng)度變化的耐受能力。實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，在500 mM NaCl的存在下，該分子內(nèi)二倍體結(jié)構(gòu)的解鏈溫度可以達(dá)到54.2℃。在4℃、25℃及37℃下用該傳感器進(jìn)行Pb2+的定量檢測(cè)，檢測(cè)結(jié)果基本相

4、同，表明該傳感器可以應(yīng)用于更寬的溫度范圍。
　　(2)我們對(duì)Cu2+ DNAzyme進(jìn)行了重構(gòu)，重構(gòu)后的結(jié)構(gòu)與之前的DNAzyme結(jié)構(gòu)相似，但是Cu2+的存在卻可以顯示更高的酶活性。在5μM Cu2+和30μM抗壞血酸的存在下，體系可以獲得23倍的熒光信號(hào)增長(zhǎng)，同時(shí)表現(xiàn)出了杰出的靈敏度和選擇性，檢測(cè)限為0.6 nM，線性范圍是5-500 nM。Cu2+ DNAzyme傳感器中分子內(nèi)莖-環(huán)結(jié)構(gòu)的使用不僅有效地保證了檢測(cè)體系具有較低的

5、背景熒光，而且莖-環(huán)結(jié)構(gòu)的高穩(wěn)定性(在1.5 M NaCl的存在下解鏈溫度可以達(dá)到71℃)還極大地提高了該傳感器對(duì)溫度變化及離子強(qiáng)度變化的耐受能力。我們?cè)?℃、20℃、25℃及37℃下使用該傳感器制作了Cu2+檢測(cè)的標(biāo)準(zhǔn)曲線，發(fā)現(xiàn)這四個(gè)溫度下得到標(biāo)準(zhǔn)曲線幾乎完全重合，說明利用該傳感器可以在4-37℃的溫度范圍內(nèi)給出近乎相同的檢測(cè)結(jié)果。同時(shí)我們發(fā)現(xiàn)NaCl濃度在0.8-3.0 M時(shí)，F(xiàn)/F0基本可以保持不變，也就是說我們?cè)O(shè)計(jì)重構(gòu)的Cu2+

6、 DNAzyme熒光傳感器可以在0.8-3.0M的離子強(qiáng)度范圍內(nèi)進(jìn)行正常工作。
　　(3)本章基于重構(gòu)的特異性Cu2+ DNAzyme和G-四鏈體DNA酶協(xié)同作用設(shè)計(jì)了免標(biāo)記，價(jià)格低廉，操作簡(jiǎn)單的比色型Cu2+傳感器，使用了可形成G-四鏈體的富G序列及與之互補(bǔ)的部分富C序列，它們分別連接在我們重構(gòu)的Cu2+ DNAzyme的底物鏈的5’-端及3’-端，由于重構(gòu)的Cu2+ DNAzyme會(huì)形成分子內(nèi)莖-環(huán)結(jié)構(gòu)，以致富G序列被部分的包

7、埋或部分的形成在該莖-環(huán)結(jié)構(gòu)中，當(dāng)?shù)孜镦溤贑u2+的存在下被切成兩段之后，G-四鏈體結(jié)構(gòu)形成或者被破壞，在氯化血紅素(Hemin)的存在下酶活性發(fā)生變化，催化H2O2和2，2’-氨基-二(3-乙基-苯并噻唑啉-6-磺酸)(ABTS)氧化反應(yīng)能力不同。基于這種原理，設(shè)計(jì)‘Turn-on’和‘Turn-off’兩種比色型Cu2+傳感器。對(duì)于‘Turn-on’型傳感器，由于分子內(nèi)莖-環(huán)結(jié)構(gòu)的形成可以有效的降低其檢測(cè)背景，而且Cu2+ DNAz

8、yme和G-四鏈體-Hemin DNA酶的協(xié)同放大作用，進(jìn)一步提高了其檢測(cè)限，最終其線性范圍為8-200 nM，檢測(cè)限為3.9 nM，同時(shí)可以實(shí)現(xiàn)裸眼檢測(cè)?！甌urn-off'模式的原理與‘Turn-on’模式大致相同。雖然‘Turn-off’模式的檢測(cè)限不如‘Turn-on’模式低，但是同時(shí)結(jié)合兩種模式的比色型Cu2+傳感器使用，可以有效的防止假陽(yáng)性或假陰性結(jié)果。同時(shí)我們?cè)凇甌urn-on’比色型Cu2+傳感器的基礎(chǔ)上利用Hg2+可以

9、與胸腺嘧啶(T)形成金屬堿基對(duì)(T-Hg2+-T)的原理來設(shè)計(jì)新的‘Turn-on’比色型傳感器進(jìn)行檢測(cè)，檢測(cè)限達(dá)到4.8nM。
　?、蛏限D(zhuǎn)換發(fā)光納米材料在生物檢測(cè)方面的應(yīng)用。
　　上轉(zhuǎn)換發(fā)光納米材料是一類吸收低能量光子、發(fā)射高能量光子的新型熒光材料，具有化學(xué)穩(wěn)定性好、毒性低、無背景熒光、信噪比高等優(yōu)點(diǎn)，另外在近紅外光激發(fā)下具有組織穿透能力深、對(duì)生物組織無損傷、近乎零背景熒光干擾、成像靈敏度高等諸多優(yōu)點(diǎn)，在生物成像和生物分析

10、中有著廣泛的應(yīng)用前景。
　　(4)本章使用水熱法一步合成了形貌可控，水溶性好，羧基官能團(tuán)修飾的NaLuF4∶Yb3+/Er3+納米材料，在合成中使用小分子二元酸（丙二酸）作為配體，代替了傳統(tǒng)方法中使用油酸作為配體，這種合成方法不但解決了上轉(zhuǎn)換納米材料的水溶性問題，而且合成之后的納米晶體表面直接修飾有-COOH官能團(tuán)，可以和多種生物分子偶聯(lián)，為上轉(zhuǎn)換發(fā)光納米晶體在生物標(biāo)記應(yīng)用中靈敏性和特異性的提高提供了前期基礎(chǔ)。隨后在上轉(zhuǎn)換納米晶體