B、C基因型乙型肝炎病毒調(diào)控元件的活性差異及機(jī)制研究.pdf

1、盡管安全有效的疫苗應(yīng)用至今已有近三十年，但乙型肝炎病毒的感染仍然是全球重大的公共衛(wèi)生問題之一。基于HBV基因組序列的差異目前將其分為A～J十個基因型，我國是HBV感染的高發(fā)區(qū)，廣泛分布的主要是B和C兩種基因型。研究發(fā)現(xiàn)B、C基因型HBV感染者在病毒學(xué)、臨床表現(xiàn)及對干擾素的反應(yīng)方面存在較大差異。但目前為止引起B(yǎng)、C基因型HBV表現(xiàn)差異的具體機(jī)制尚未完全闡明。
　　HBV全長3.2kb，其調(diào)控元件包含C、S1、S2與X四個啟動子以及E

2、nhⅠ和EnhⅡ兩個增強(qiáng)子。鑒于HBV調(diào)控元件對其復(fù)制、轉(zhuǎn)錄及蛋白表達(dá)的重要調(diào)控作用，我們通過對B、C基因型HBV調(diào)控元件的活性進(jìn)行比較分析，以期找出兩個基因型表現(xiàn)差異的原因及機(jī)制。
　　本研究主要從以下幾部分展開論述：
　　第一部分 通過對B、C基因型HBV序列進(jìn)行同源分析，分別獲得這兩個基因型HBV基因組的保守序列。之后以本實(shí)驗(yàn)室保存的病毒株作為模板進(jìn)行調(diào)控序列的擴(kuò)增，并將差異位點(diǎn)序列突變?yōu)楸Ｊ匦蛄?，成功?gòu)建了B、C基因

3、型保守的HBV各調(diào)控元件的螢火蟲熒光素酶報告質(zhì)粒，為后續(xù)研究奠定了基礎(chǔ)。
　　第二部分 通過比較B、C基因型保守的HBV各調(diào)控元件的活性發(fā)現(xiàn)Xp-EnhⅠ、Xp、及BCp活性B、C基因型間無統(tǒng)計學(xué)差異，Cp-EnhⅡ、Cp及SpⅠ活性B型高于C型，而SpⅡ活性B型低于C型。隨后通過對SpⅡ進(jìn)行B、C基因型3’端置換發(fā)現(xiàn)兩個區(qū)域?qū)pⅡ活性均有較大影響。
　　第三部分 通過比較證實(shí)B、C基因型HBV EnhⅡ活性確實(shí)存在差異，

4、并在B型EnhⅡ序列中進(jìn)行四個C型序列突變，發(fā)現(xiàn)1635-1640與1654位點(diǎn)對B、C基因型EnhⅡ活性差異起重要作用。隨后通過凝膠遷移阻滯實(shí)驗(yàn)初步鑒定出細(xì)胞內(nèi)存在與B型1635-1640位點(diǎn)結(jié)合的核蛋白，并通過DNA pull down篩選以及質(zhì)譜鑒定獲得PARP1、SFPQ、NonO、Ku70及Ku80五個候選結(jié)合蛋白。我們的結(jié)果表明轉(zhuǎn)錄因子與EnhⅡ1635-1640位點(diǎn)的結(jié)合及對其活性的影響可能是B、C基因型HBV表現(xiàn)差異的一