粘紅酵母遺傳表達系統(tǒng)的建立.pdf

1、粘紅酵母(Rhodotorula glutinis)是生產胡蘿卜素、油脂、輔酶Q10等很有潛力的工業(yè)菌種，有很高的生物量和甲羥戊酸通量，并可在很多便宜易得的培養(yǎng)基上生長。利用同源重組將外源基因整合到酵母染色體上實現(xiàn)外源基因穩(wěn)定表達的技術已在釀酒酵母、產朊假絲酵母和乳酸克魯維酵母等多種微生物中廣泛應用。其中以rDNA為同源整合的靶順序構建的載體，既克服了通常整合載體只有幾個拷貝的局限，同時又保留整合載體穩(wěn)定性好的特點。酵母轉化技術也日益成

2、熟。
　　 本文以遺傳和分子生物學信息匱乏的工業(yè)菌株As.2.102為研究對象，通過整合表達載體的構建、表達系統(tǒng)和轉化系統(tǒng)的建立，提供一種新的工業(yè)化生產一系列目的產物的菌株材料或相應的微生物反應器的技術平臺。
　　 比較粘紅酵母菌與不同酵母菌株的主要生理生化特性和發(fā)酵特征，以及研究在形態(tài)學、生長和抗生素敏感性的特征。
　　 以質粒pPICZαA作為骨架，以質粒pGAPZαA的組成型3'磷酸甘油醛脫氫酶啟動子gap

3、為啟動元件，博來霉素基因(shble)為抗性篩選標記，綠色熒光蛋白酶基因(GFP)為報告基因，以從粘紅酵母基因組擴增得到的兩段621bp的26SrDNA和555bp的5.8SrDNA-ITS序列片段為同源整合位點，構建了粘紅酵母整合性表達載體pGAPZ/rD/GFP。
　　 通過改良的PEG介導的醋酸鋰感受態(tài)細胞轉化法和優(yōu)化粘紅酵母菌原生質體制備、再生方法，建立適于As2.102菌株的轉化方法，獲穩(wěn)定的轉化效率。說明載體pGAP

4、Z/rD/GFP能同源整合到染色體上；通過抗性篩選和熒光檢測，重組子能表達Zeocin抗性基因和綠色熒光蛋白基因，并且構建載體在粘紅酵母基因工程菌中具有良好的穩(wěn)定性，傳六代保留率在95％以上。說明構建載體的適用性，以及成功建立粘紅酵母的表達系統(tǒng)、轉化系統(tǒng)。
　　 在本文中還嘗試利用RACE技術擴增和克隆相關的基因片段和以pMD18T為基礎的啟動子探針載體篩選有啟動活性的基因組部分酶切片段，建立這兩種策略來克隆粘紅酵母自身的啟動子