一年生膜莢黃芪有效成分與拮抗環(huán)磷酰胺毒副作用研究.pdf

1、目的:通過①比較不同生長年限栽植膜莢黃中黃酮類、皂苷類成分的高效液相色譜和薄層色譜信息，以及毛蕊異黃酮、芒柄花素、總黃酮和多糖的含量；②分離純化一年生栽植膜莢黃芪中黃芪多糖，探討其對小鼠巨噬細(xì)胞 RAW264.7釋放NO的影響；③觀察一年生膜莢黃芪超微粉對環(huán)磷酰胺所致小鼠免疫抑制和腎臟毒副作用的影響，為一年生栽植膜莢黃芪的開發(fā)與利用提供依據(jù)。
　　方法：①采用HPLC-ELSD方法比較一、二和三年生膜莢黃芪中皂苷類成分，色譜柱為A

2、gilent Zorbax SB-C18(250 mm×4.6 mm，5μm)，流動(dòng)相為乙腈－水，二元梯度洗脫15％～50%；流速0.8 mL·min-1；洗脫時(shí)間90 min，柱溫30℃，檢測器參數(shù)：漂移管溫度為105℃，載氣壓力為2.70 bar；TLC方法比較一、二和三年生膜莢黃芪中皂苷類成分，以氯仿－甲醇－水（13:6:2）為展開劑，10%硫酸乙醇溶液為顯色劑；采用HPLC-DAD方法比較一、二和三年生膜莢黃芪中黃酮類成分及毛蕊

3、異黃酮和芒柄花素的含量，色譜柱為 BDS Hypersil C18柱（250 mm×4.6 mm，5μm，Thermo）；二極管陣列檢測器（DAD），流動(dòng)相為乙腈－水，梯度洗脫50 min，流速為1.0 mL·min-1，檢測波長為254 nm；采用TLC方法比較膜莢黃芪中黃酮類成分，以甲苯－乙酸乙酯－甲酸（8:5:1）溶液為展開劑，二氨基苯甲醛的10%硫酸乙醇溶液為顯色劑；苯酚-硫酸法測定不同年生膜莢黃芪中多糖的含量，并進(jìn)行比較；水提

4、、醇沉、膜透析和葡聚糖凝膠柱法分離純化多糖，并采用凝膠色譜法測定相對分子質(zhì)量。②采用膜莢黃芪多糖（ASP40%Ⅰ、ASP60%Ⅰ、ASP60%Ⅱ）刺激小鼠巨噬細(xì)胞RAW264.7，用Griess法測定NO的含量。③取昆明種小鼠隨機(jī)分為正常對照組、模型組及一年生膜莢黃芪超微粉2 g·kg-1和4 g·kg-1組，連續(xù)灌胃11 d，第5和10日除正常組腹腔注射等量的生理鹽水外，其它各組均腹腔注射環(huán)磷酰胺80 mg·kg-1，測定小鼠免疫器官

5、胸腺指數(shù)、脾臟指數(shù)、外周白細(xì)胞和血尿素氮含量；另取一批昆明種小鼠隨機(jī)分為正常對照組、模型組及一年生膜莢黃芪超微粉2 g·kg-1和4 g·kg-1組，連續(xù)灌胃10 d，第3、6和9日除正常對照組外各組均腹腔注射給予80 mg·kg-1，第10日測定腎組織丙二醛的含量。
　　結(jié)果：①不同年生的膜莢黃芪藥材皂苷類成分圖譜在概貌上基本一致，均出現(xiàn)12個(gè)特征峰，各共有峰相對保留時(shí)間的RSD在0.112～0.394%（均小于3%），而共有峰

6、相對峰面積的RSD在27.23～143.23%（均大于3%）；薄層色譜圖譜的概貌基本一致，Rf相同的位置均出現(xiàn)對應(yīng)的斑點(diǎn)，但是斑點(diǎn)大小及顏色深淺有所差異；黃酮類成分指紋圖譜有7個(gè)共有峰，其圖譜在概貌上基本一致，各共有峰相對保留時(shí)間的RSD在0.008～0.097%之間（均小于3%），而共有峰相對峰面積的RSD在9.61～72.95%之間（均大于3%）；薄層色譜圖譜的概貌基本一致，Rf相同的位置均出現(xiàn)相同的斑點(diǎn)，但是斑點(diǎn)大小和顏色深淺有所

7、差異；一、二和三年生膜莢黃芪中主要成分含量分別為毛蕊異黃酮：0.337、0.121和0.119 mg.g-1；芒柄花素：0.101、0.031和0.032 mg.g-1；總黃酮：1.02、1.23和1.79 mg.g-1；總多糖：42.31、23.96和32.52 mg.g-1；分離得到5個(gè)部位黃芪多糖，其中ASP40%Ⅰ、ASP60%Ⅰ和 ASP60%Ⅱ3個(gè)部位為較純的多糖，其重均分子質(zhì)量分別為3.0×105、1.5×105和0.45

8、×105。②實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，一年生膜莢黃芪多糖 ASP40%Ⅰ、ASP60%Ⅰ和ASP60%Ⅱ分別在6.25～200、3.125～200和3.125～200μg·mL-1范圍內(nèi)刺激RAW264.7細(xì)胞分泌NO；3.125～25μg·mL-1范圍內(nèi)，作用的大小依次為ASP40%Ⅰ、ASP60%Ⅰ和ASP60%Ⅱ。③與正常對照組比較，模型組小鼠的胸腺、脾臟指數(shù)及外周血白細(xì)胞計(jì)數(shù)均明顯降低，腎組織丙二醛含量明顯升高；與模型組比較，2 g·kg-

9、1和4 g·kg-1一年生膜莢黃芪超微粉組胸腺指數(shù)及外周血白細(xì)胞計(jì)數(shù)均明顯升高，腎組織丙二醛含量明顯降低，4 g·kg-1一年生黃芪超微粉組血尿素氮含量明顯降低。
　　結(jié)論：①一年生膜莢黃芪中皂苷類成分的種類與二、三年生基本保持一致，但不同種類皂苷類成分質(zhì)量差異較大；膜莢黃芪中黃酮類成分含量隨著年限的增長而增加，黃酮類成分的種類基本保持一致；一年生膜莢黃芪中皂苷和黃酮的薄層色譜與二、三年生在顏色和形態(tài)基本一致，但斑點(diǎn)的大小有所差異