黃芩苷對子癇前期血清誘導HUVECs增殖和ICAM-1表達的影響.pdf

1、目的:觀察子癇前期患者(濕熱瘀結證）臍帶血管內皮細胞細胞間粘附分子-1(ICAM-1)的表達；探討子癇前期（PE）患者的血清對體外培養(yǎng)的人臍靜脈血管內皮細胞(HUVECs)增殖和ICAM-1表達的影響；觀察不同濃度黃芩苷(BAI)對血清誘導后細胞增殖的影響，進而選擇最佳藥物濃度；觀察藥物對HUVECs細胞上ICAM-1表達的影響。探討黃芩苷對PE濕熱瘀結證防治作用的靶點及可能機制，規(guī)范藥物最佳有效濃度，為黃芩苷的進一步臨床廣泛應用提供理

2、論和實驗依據。
　　方法:第一部分臨床觀察中選取濕熱瘀結證子癇前期PE患者50例及正常妊娠孕婦(NP）50例。子癇前期的西醫(yī)臨床診斷標準參考《婦產科學》(第七版)。中醫(yī)辨證分型診斷標準參照文獻。無菌采血后分離出血清，56℃30min滅活補體，分裝后-20℃保存?zhèn)溆?。適宜的分娩方式下收集臍帶-80℃保存。隨機選取PE和NP組中的各20段臍帶，SABC法測定血管內皮上細胞ICAM-1表達。第二部分實驗研究，人臍靜脈內皮細胞株（簡稱HU

3、VECs)，理論上可無限次的傳代培養(yǎng)，易于實驗操作。含10％子癇前期血清 DMEM培養(yǎng)基誘導HUVECs48h建立PE患者體內內皮細胞損傷模型。正常孕婦的血清48h的HUVECs作為陰性對照。分子癇前期模型a組，正常b組（陰性對照組），黃芩苷治療c組（PE模型+黃芩苷），共3大組。收獲a組和b組融合成單層呈鋪路石狀HUVECs，調整細胞密度，分別接種到96孔板中，待細胞貼壁后，棄舊培養(yǎng)液，加入含或不含黃芩苷的培養(yǎng)基，黃芩苷按高低濃度梯度

4、加入對應的孔中，復5個平行孔，做好標記。培養(yǎng)箱中孵育24h進行 cck-8實驗。進行三次實驗，分別調整細胞濃度為2×104細胞/孔，1×104細胞/孔，5×103細胞/孔，每次實驗重復三次。收獲 a組，b組融合成單層呈鋪路石狀的HUVECs，根據摸索結果，調整最佳細胞密度接種到96孔板中，方法同上，根據細胞增殖實驗結果，調整黃芩苷不同濃度后加入對應的孔中進行孵育，操作同上。傳代細胞貼壁后，建立子癇前期模型 a組和正常妊娠 b組，進行標記

5、；設立藥物治療c組：PE模型造好換含有效濃度的黃芩苷培養(yǎng)液，干預24h。收集a、b、c三組細胞，RT-PCR、蛋白印跡法方法檢測內皮細胞中ICAM-1表達,記錄數據進行比較。
　　結果:（1）臨床臍帶標本的血管內皮細胞中ICAM-1陽性表達于子癇前期模型（PE）組，呈棕褐色胞漿著色。免疫組化平均光密度值示PE組(51.42±4.46)顯著高于正常妊娠（NP）組(14.68±2.73)，有顯著統(tǒng)計學意義。（2）PE內皮損傷模型組內皮

6、細胞增殖活性(OD值1.49±0.08)較NP組(1.18±0.07)有明顯的增加，p＜0.01；黃芩苷抑制PE組內皮細胞的增殖，有統(tǒng)計學意義。（3）PE模型組內皮細胞ICAM-1 mRNA(倍增值4.68±0.20)表達明顯高于 NP組(1.16±0.19)，p＜0.01；黃芩苷(60μg/ml)干預后顯著抑制了PE組ICAM-1 mRNA的表達（1.51±0.07），p＜0.01，與 NP組相比差異有統(tǒng)計學意義。（4）PE組ICAM

7、-1蛋白(0.64±0.05)表達顯著高于NP組(0.37±0.05)，p＜0.01；黃芩苷(60μg/ml)干預后明顯降低了PE組 ICAM-1蛋白的表達（0.41±0.01），P＜0.01，但是與NP組相比，藥物干預后ICAM-1蛋白的表達變化無明顯統(tǒng)計學差異，p＞0.05。
　　結論:（1）臨床觀察中濕熱瘀結證型子癇前期患者臍帶內皮細胞ICAM-1出現(xiàn)陽性表達。（2）體外實驗中濕熱瘀結證子癇前期患者血清促進人臍靜脈血管內皮細

8、胞的失衡性增殖；黃芩苷抑制PE血清誘導內皮細胞的失衡性增殖以及表面粘附分子ICAM-1的過表達；黃芩苷在有效濃度為60μg/ml時，內皮細胞的增殖得到有效抑制，同時細胞增殖活性與正常組最為接近。黃芩苷對子癇前期（濕熱瘀結證）的防治有一定作用，可能是通過抑制病理環(huán)境下血管內皮細胞的失衡性增殖，抑制細胞表面粘附分子的過表達從而維持內皮細胞的增殖與凋亡平衡，降低血管內皮的粘附，保護血管內皮細胞來實現(xiàn)的。（3）基礎實驗研究中內皮細胞接種到96孔