來氟米特對HMGB-1誘導的臍靜脈內皮細胞ICAM-1表達的影響及其機制研究.pdf

1、目的:類風濕關節(jié)炎(rheumatoid arthritis,RA)是一種慢性系統(tǒng)性炎癥疾病,隨著免疫抑制劑的廣泛應用,致殘率已顯著下降,但心血管疾病作為其遠期并發(fā)癥已經(jīng)成為RA患者的首要死亡原因,其中早發(fā)動脈粥樣硬化(atherosclerosis,As)占有較高的比率。目前認為動脈粥樣硬化是一種炎癥性疾病,多種細胞因子與單核/巨噬細胞、血管內皮細胞之間形成的炎癥反應網(wǎng)絡,貫穿于動脈粥樣硬化發(fā)生、發(fā)展的全過程。因此研究細胞因子在RA患

2、者動脈粥樣硬化的發(fā)生和發(fā)展中的作用具有重要的臨床價值。
　　 高遷移率族蛋白(high mobility group box protein HIMGB)-1是RA發(fā)病過程中重要的炎癥因子。HMGB-1還可激活單核/巨噬細胞系統(tǒng)加速動脈粥樣硬化的發(fā)生,說明HMGB-1與動脈粥樣硬化相關,但其機制尚不十分明確。Toll樣受體4(toll like receptor4,TLR4)是一類細胞表面信號傳導跨膜受體,HMGB-1的受體之一

3、,它可通過多種途徑影響動脈粥樣硬化的形成。那么,HMGB-1是否通過與受體TLR4的結合影響了內皮細胞功能而促進動脈粥樣硬化的發(fā)生發(fā)展呢?
　　 臨床研究顯示,早期應用慢作用藥物可以降低RA患者心血管疾病的發(fā)病率。來氟米特(leflunomide,LEF)屬慢作用藥物的一種,具有抗炎及免疫抑制作用。它可以通過改善脂質代謝而降低動脈粥樣硬化的發(fā)生。但尚未見LEF對內皮細胞功能影響的研究報導。本實驗即采用體外細胞培養(yǎng)的方法,觀察HM

4、GB-1對人臍靜脈內皮細胞(human umbilical veinendothelial cells,HUVEC)功能的影響及來氟米特對內皮細胞是否具有保護作用,并探討其可能機制,為RA患者早發(fā)動脈粥樣硬化的防治提供一定的理論依據(jù)。
　　 方法:人臍靜脈內皮細胞應用DMEM培養(yǎng)基進行體外培養(yǎng),其中含10％胎牛血清及100KU/L青霉素、100mg/L,鏈霉素。MTT檢測不同濃度LEF對臍靜脈內皮細胞生長的影響,按MTT結果將細

5、胞分為正常對照組,HMGB-1刺激組(10ng/ml),HMGB-1分別加10μg/ml、20μg/ml、40μg/mlLEF干預組。免疫細胞化學和Western blotting檢測臍靜脈內皮細胞的細胞間粘附分子(intercellular adhesion molecule,ICAM)-1蛋白的表達;RT-PCR檢測細胞ICAM-1和TLR4 mRNA的表達。
　　 結果:
　　 1 不同濃度LEF對HMGB-1誘導

6、的臍靜脈內皮細胞生長的影響
　　 MTT結果顯示,LEF呈濃度依賴性抑制HMGB-1誘導的內皮細胞增殖,2.5μg/ml及5μg/ml LEF對內皮細胞生長抑制率很低,160μg/ml的LEF24h的抑制率可達82％。
　　 2 HUVEC細胞ICAM-1蛋白的表達情況
　　 免疫細胞化學結果顯示,ICAM-1蛋白陽性顆粒主要表達于細胞漿中,呈棕黃色顆粒。正常對照組可見少量表達,HMGB-1刺激后細胞的ICAM-

7、1蛋白表達顯著增加。而LEF干預組的ICAM-1陽性表達強度較HMGB-1組降低,隨著LEF濃度的增加,ICAM-1蛋白的表達逐漸減弱。
　　 Western blowing結果顯示,HMGB-1刺激24h后HUVEC細胞ICAM-1表達明顯升高,與正常對照組相比,差異具有統(tǒng)計學意義(P＜0.01)。LEF干預組ICAM-1蛋白表達與HMGB-1組相比表達下降,并隨LEF濃度的增加而逐漸降低。
　　 3 HUVEC細胞I

8、CAM-1 mRNA的表達情況
　　 RT-PCR結果顯示,HMGB-1刺激細胞后可以明顯上調ICAM-1 mRNA的表達,與對照組相比差異具有顯著統(tǒng)計學意義(P＜0.01)。LEF組ICAM-1表達明顯下降,以40μg/ml LEF組為著,與HMGB-1組相比差異有顯著統(tǒng)計學意義(p＜0.01)。
　　 4 HUVEC細胞TLR4 mRNA的表達情況
　　 RT-PCR結果表明,正常細胞中TLR4 mRNA的表

9、達量很少,HMGB-1可明顯上調內皮細胞TLR4 mRNA的表達。應用LEF干預24h后TLR4的表達呈濃度依賴性下降,以40μg/ml LEF組為著,與HMGB-1組比較差異有顯著意義(P＜0.01)。
　　 5 相關性分析
　　 經(jīng)pearson相關分析,ICAM-1mRNA與TLR4 mRNA的表達水平之間呈顯著正相關(r=0.977,P=0.004)。
　　 結論:
　　 1 HMGB-1通過上調