ICAM-1和CX3CL1對(duì)內(nèi)皮細(xì)胞骨架的影響及其機(jī)制的探討.pdf

1、目的：觀察ICAM-1和 CX3CL1對(duì)人臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞（HUVECs）骨架的影響，探討其可能的機(jī)制。
　　方法：（1）觀察ICAM-1和CX3CL1對(duì)HUVECs的骨架蛋白F-actin的影響：HUVECs饑餓處理12 h；○110μM Fg刺激HUVECs30 min后，1 nM ICAM-1分別刺激HUVECs0、30、60、120、180 min；○210 nM CX3CL1分別刺激HUVECs0、30、60、120、18

2、0 min；4％多聚甲醛固定細(xì)胞后，用Alexafluor?488 phalloidin對(duì)細(xì)胞骨架蛋白F-actin進(jìn)行熒光染色，熒光顯微鏡下觀察細(xì)胞F-actin形態(tài)和分布情況。
　　(2)檢測ICAM-1和CX3CL1對(duì)HUVECs的MAPK信號(hào)通路的影響：HUVECs饑餓處理12 h；○110μM Fg刺激HUVECs30 min后1 nM ICAM-1分別刺激HUVECs0、5、15、30、60 min；○210 nM C

3、X3CL1分別刺激HUVECs0、1、5、15、30 min；○35μg/mL抗ICAM-1+10μM Fg刺激細(xì)胞30 min后，1 nM ICAM-1刺激細(xì)胞5 min、15 min和15 min、30 min；○45μg/mL抗CX3CR1抗體刺激內(nèi)皮細(xì)胞30 min后,10 nM CX3CL1刺激細(xì)胞1min和5 min；提取細(xì)胞總蛋白，Western blot檢測磷酸化p38、ERK1/2和JNK1/2和總p38、ERK1/2

4、和JNK1/2的表達(dá)水平。
　　(3)探討ICAM-1和CX3CL1介導(dǎo)的HUVECs骨架改變的機(jī)制：HUVECs饑餓處理12 h；○130μM的（SB203580p38的特異性抑制劑）、PD98059（ERK1/2的特異性抑制劑）和SP600125（JNK1/2的特異性拮抗劑）分別刺激內(nèi)皮細(xì)胞30 min后，10μM Fg刺激HUVECs30 min，隨后1 nM ICAM-1在刺激HUVECs180 min；○230μM SB

5、203580、PD98059和SP600125分別刺激HUVECs1 h后，10 nM CX3CL1刺激HUVECs120 min；固定細(xì)胞后，對(duì)細(xì)胞進(jìn)行熒光染色，熒光顯微鏡下觀察細(xì)胞F-actin形態(tài)和分布情況。
　　結(jié)果：(1)空白對(duì)照的HUVECs的細(xì)胞周邊的F-actin形成光滑而連續(xù)的外周致密帶。1 nM ICAM-1刺激HUVECs30 min后，細(xì)胞沒有明顯變化；60 min后胞質(zhì)內(nèi)出現(xiàn)少量應(yīng)力纖維，細(xì)胞膜外周的F-

6、actin成鋸齒狀，致密帶被破壞；120 min后，細(xì)胞周邊的F-actin基本消失，細(xì)胞質(zhì)內(nèi)出現(xiàn)大量纖細(xì)的應(yīng)力纖維；180 mim后細(xì)胞質(zhì)內(nèi)出現(xiàn)密集的貫穿整個(gè)細(xì)胞的應(yīng)力纖維，細(xì)胞變形。10 nM CX3CL1刺激HUVECs30 min后胞質(zhì)內(nèi)出現(xiàn)少量應(yīng)力纖維，細(xì)胞外周的F-actin成鋸齒狀，致密帶被破壞；60 min后，細(xì)胞質(zhì)內(nèi)出現(xiàn)大量纖細(xì)的應(yīng)力纖維，而細(xì)胞周邊的F-actin基本消失；120 min后細(xì)胞質(zhì)內(nèi)出現(xiàn)密集的貫穿整個(gè)細(xì)

7、胞的應(yīng)力纖維，細(xì)胞變形；180 min后在胞質(zhì)內(nèi)的應(yīng)力纖維變短而稀疏。
　　(2)1nM ICAM-1刺激HUVECs5 min后p38、ERK1/2和JNK1/2磷酸化水平高于空白對(duì)照的細(xì)胞，15 min后磷酸化ERK1/2和JNK1/2的表達(dá)水平達(dá)峰值，而磷酸化p38的的表達(dá)水平在30 min后達(dá)峰值；10 nM CX3CL1刺激HUVECs1 min后p38、ERK1/2和JNK1/2磷酸化水平高于空白對(duì)照的細(xì)胞，三者的磷酸

8、化水平均在5 min后達(dá)峰值；5μg/mL抗1nM ICAM-1抗體抑制ICAM-1介導(dǎo)的p38、ERK1/2和JNK1/2磷酸化水平的上調(diào)；5μg/mL抗CX3CR1抗體抑制10 nM CX3CL1介導(dǎo)的的p38、ERK1/2和JNK1/2磷酸化水平的上調(diào)。
　　(3)30μM SB203580提前干預(yù)后，1nM ICAM-1刺激內(nèi)皮細(xì)胞后引起的F-actin的重排及應(yīng)力纖維的形成被抑制，30μM SB203580和PD9805