太白楤木皂苷及其活性單體對(duì)心肌缺血-再灌注損傷的保護(hù)作用及機(jī)制研究.pdf

1、近年來，無論在發(fā)達(dá)國家或在發(fā)展中國家，缺血性心臟病均是重要的致死性疾病之一，流行性廣，嚴(yán)重威脅人類健康。臨床上隨著溶栓療法、支架植入等治療技術(shù)的推廣應(yīng)用，心肌缺血/再灌注損傷（myocardial ischemia/reperfusion injury，MI/RI）成為當(dāng)今廣為關(guān)注的熱門話題。它可不可逆性損傷心肌細(xì)胞，導(dǎo)致左室功能失調(diào)及心臟衰竭，最終出現(xiàn)急性心肌死亡。大量研究表明，線粒體功能紊亂是MI/RI發(fā)生的主要原因，因此，開發(fā)安全

2、有效的MI/R損傷防治藥物迫在眉睫。
　　太白楤木（Aralia taibaiensis）廣泛分布于我國中西部秦巴山區(qū)等地，其根皮提取物主要化學(xué)成分為三萜皂苷。早期研究顯示，太白楤木皂苷（total saponins extracted from Aralia taibaiensis，sAT）具有抗炎、抗腫瘤、降血脂、降血糖等藥理作用，對(duì)心腦血管系統(tǒng)也有一定影響，并可提高機(jī)體耐缺氧的能力等。故本研究旨在探討sAT及其活性單體對(duì)MI

3、/RI的保護(hù)作用及其機(jī)制，為尋找安全有效的MI/R損傷防治藥物提供理論依據(jù)。
　　【目的】
　　1.確定sAT對(duì)MI/RI的保護(hù)作用及其機(jī)制。
　　2.針對(duì)sAT分離得到的12個(gè)單體進(jìn)行心肌保護(hù)作用的篩選，明確sAT的主要藥效物質(zhì)。
　　3.闡明該主要藥效物質(zhì)發(fā)揮心肌保護(hù)作用的機(jī)制。
　　【方法】
　　1.可逆性冠脈左前降支結(jié)扎缺血30 min再灌注3 h復(fù)制MI/RI模型，將SD大鼠隨機(jī)分為假手術(shù)組

4、、模型組、sAT低、中、高劑量組，每組10只。通過試劑盒檢測(cè)血清中乳酸脫氫酶（lactate dehydrogenase，LDH）、肌酸激酶同工酶（creatine kinase-MB，CK-MB）、超氧化歧化酶（superoxide dismutase，SOD）、丙二醛（malondialdehyde，MDA）、過氧化氫酶（catalase，CAT）及谷胱甘肽過氧化物酶（glutathione peroxidase，GSH-Px）水平

5、；采用依文思藍(lán)-氯化三苯基四氮唑藍(lán)（evans blue-2,3,5-tetrazolium chloride，EB-TTC）雙染法測(cè)定心肌梗死面積，蘇木精-伊紅染色法觀察心肌病理學(xué)形態(tài)變化，TUNEL染色法明確心肌組織凋亡情況。
　　2.采用H9c2心肌細(xì)胞模擬缺氧/復(fù)氧（anoxia/reoxygenation，A/R）2 h/4 h損傷模型，參考sAT的藥效，比較由sAT分離得到的12個(gè)三萜皂苷單體對(duì)細(xì)胞活力、LDH、CK-

6、MB、細(xì)胞色素c（cytochrome c，Cyt c）表達(dá)及caspase-3活性的影響，初步確定sAT中主要藥效物質(zhì)。
　　3.首先，采用結(jié)扎冠狀動(dòng)脈復(fù)制C57小鼠MI/RI（30 min/3 h）模型，觀察CHS低、中、高劑量對(duì)小鼠心功能、血清中LDH和CK-MB水平、心梗面積、心臟組織病理性損傷及線粒體形態(tài)的影響；其次，建立A/R（2 h/4 h）H9c2心肌細(xì)胞損傷模型，檢測(cè)CHS對(duì)H9c2細(xì)胞存活率及細(xì)胞培養(yǎng)上清液中L

7、DH水平，并觀察細(xì)胞線粒體膜電位及活性氧（reactive oxygen species，ROS）的變化，進(jìn)一步通過裂解細(xì)胞提取蛋白，檢測(cè)相關(guān)蛋白尤其是單磷酸腺苷活化蛋白激酶（AMP-activated protein kinase，AMPK）及SIRT3蛋白的含量變化；最后，采用結(jié)扎冠狀動(dòng)脈復(fù)制SIRT3-/-小鼠MI/RI（30 min/3 h）模型，比較CHS對(duì)C57小鼠和SIRT3-/-小鼠心梗面積及心肌組織凋亡的影響，并檢測(cè)A

8、MPK及 SIRT3蛋白含量的變化。
　　【結(jié)果】
　　1.揭示 sAT能夠顯著抑制心肌損傷酶 LDH、CK-MB釋放；升高 SOD、CAT及GSH-Px的活性，同時(shí)減少M(fèi)DA的含量；明顯降低大鼠心肌梗死面積，逆轉(zhuǎn)心肌組織的病理學(xué)改變，并有效抑制心肌組織細(xì)胞凋亡。
　　2.相比其他11個(gè)皂苷單體，TA35即CHS可顯著增強(qiáng)H9c2心肌細(xì)胞存活率，降低細(xì)胞上清中CK-MB、LDH的釋放，逆轉(zhuǎn)caspase-3活性增強(qiáng)并降

9、低Cyt c蛋白表達(dá)，進(jìn)而抑制H9c2心肌細(xì)胞凋亡。研究發(fā)現(xiàn)TA35的心肌保護(hù)作用與sAT相當(dāng)。故初步確定CHS是sAT的主要藥效物質(zhì)。
　　3. CHS可顯著改善小鼠心功能，降低LDH及CK-MB水平，縮小心梗面積，減緩心肌病理性損傷，同時(shí)維持心肌線粒體形態(tài)。進(jìn)一步，CHS在增加H9c2心肌細(xì)胞活力降低細(xì)胞上清中LDH釋放的同時(shí)，可逆轉(zhuǎn)線粒體膜電位的下降并降低線粒體內(nèi)ROS生成。具體保護(hù)作用可能為：CHS激活A(yù)MPK，增加氧化態(tài)

10、煙酰胺腺嘌呤二核苷酸（nicotinamide adenine dinucleotide，NAD+）水平，進(jìn)而上調(diào)SIRT3蛋白，且SIRT3又可脫乙?；渭っ窧1活化AMPK，進(jìn)一步加強(qiáng)效應(yīng)。最后，SIRT3基因敲除后，與正常C57小鼠相比，其心肌梗死及組織凋亡均較為嚴(yán)重。
　　【結(jié)論】
　　1.證實(shí)了sAT能夠改善MI/RI，該預(yù)防作用很大程度上基于其顯著的抗氧化、抗凋亡作用。
　　2.明確TA35即CHS是sAT