鄰苯二甲酸二丁酯和苯并(a)芘對Leydig細(xì)胞激素合成的影響及機(jī)制研究.pdf

1、目前有機(jī)污染物在環(huán)境中廣泛分布，尤其是持久性有機(jī)污染物對水環(huán)境的污染日益嚴(yán)重。我國水環(huán)境皆受到不同程度POPs的污染，污染種類以鄰苯二甲酸酯類和多環(huán)芳烴類尤為突出。人群可能同時長期低劑量暴露于這兩類污染物，因此評價這兩類化合物的聯(lián)合作用對人類健康的影響很有必要。鄰苯二甲酸二丁酯和苯并(a)芘分別是這兩類化合物中典型和具有代表性的污染物。雖然已有研究表明這兩種化合物均具有雄性生殖發(fā)育毒性，但迄今為止未見有這兩種物質(zhì)聯(lián)合作用下的生殖毒性研究

2、報道，尤其是低劑量長期暴露的生殖毒性。既往研究表明，睪丸Leydig細(xì)胞是這兩種化合物的主要靶細(xì)胞，可以影響睪酮的合成和分泌。本課題以DBP和BaP作為受試物分別代表PAEs和PAHs，以青春期雄性SD大鼠作為研究對象，采用亞慢性染毒方式，給予較低劑量的DBP和BaP，建立大鼠長期低劑量暴露模型；聚焦于觀察DBP和BaP單獨(dú)或聯(lián)合染毒對青春期大鼠睪丸及Leydig細(xì)胞形態(tài)、結(jié)構(gòu)和功能的影響。此外，Leydig細(xì)胞合成睪酮涉及多種調(diào)節(jié)因子

3、和合成酶，因此，本研究采用Realtime-PCR、Western blot等手段檢測與睪酮合成密切相關(guān)的膽固醇跨膜轉(zhuǎn)運(yùn)調(diào)節(jié)因子、睪酮合成關(guān)鍵酶、睪酮合成分泌調(diào)節(jié)激素受體、以及相關(guān)的調(diào)節(jié)因子在轉(zhuǎn)錄水平或翻譯水平的變化以探討相關(guān)機(jī)制，旨在增進(jìn)對此類環(huán)境內(nèi)分泌干擾物雄性生殖毒性及其機(jī)制的了解，為進(jìn)一步深入研究奠定基礎(chǔ)。 實(shí)驗方法： 1.實(shí)驗動物及分組情況 4.5周齡健康雄性SPF級SD大鼠168只，體重(89±17)

4、g，由第三軍醫(yī)大學(xué)實(shí)驗動物中心提供。按隨機(jī)數(shù)字法隨機(jī)分為7組，即溶劑對照組、DBP低劑量組、DBP高劑量組、BaP低劑量組、BaP高劑量組、DBP+BaP低劑量聯(lián)合組、DBP+BaP高劑量聯(lián)合組。 2.染毒方式及取材 隔日染毒，等體積灌胃，灌胃體積2ml/kg，連續(xù)染毒90d。每天觀察動物一般狀況，每周稱量體重1次，分別于染毒后30d、60d和90d，各組隨機(jī)選取大鼠8只處死。分別取材用于檢測各項指標(biāo)。 采集股動

5、脈血，分離血清，采用放射免疫分析法測定血清睪酮含量。采血后大鼠頸椎脫臼處死，立即剖取睪丸、附睪、心、肝、脾、腎，除去上述器官周圍的脂肪結(jié)締組織，吸盡臟器表面血液后，用電子天平稱重，計算臟器系數(shù)，臟器系數(shù)以臟器重量與體重之比表示。睪丸稱重后于冰上迅速切分為約50-100mg的小塊，分裝于凍存管中液氮保存。每組隨機(jī)選取3個液氮凍存睪丸樣本，用Realtime-PCR法檢測睪丸胰島素樣因子3、黃體生成素受體、外周苯二氮卓受體mRNA表達(dá)。每組

6、隨機(jī)選取3個液氮凍存睪丸樣本，用Western blot法檢測睪丸類固醇合成急性調(diào)節(jié)蛋白、細(xì)胞色素膽固醇側(cè)鏈裂解酶、3β-羥甾脫氫酶、17β-羥甾脫氫酶、轉(zhuǎn)化生長因子α和胰島素樣生長因子I的蛋白表達(dá)。睪丸稱重后每組選取3只大鼠的右側(cè)睪丸，置于4％多聚甲醛固定液中固定，72h后常規(guī)石蠟包埋切片，HE染色，光鏡下觀察曲細(xì)精管和間質(zhì)的組織病理學(xué)變化。每組隨機(jī)選取3只大鼠的左側(cè)睪丸，取材后迅速固定于2.5％的戊二醛，然后進(jìn)行梯度酒精脫水、環(huán)氧樹

7、脂滲透、包埋、超薄切片，醋酸鈾和檸檬酸鉛染色，于透射電鏡下觀察超微結(jié)構(gòu)的改變。 3.統(tǒng)計學(xué)分析：數(shù)據(jù)經(jīng)SPSS13.0統(tǒng)計軟件處理，實(shí)驗數(shù)據(jù)均以均數(shù)士標(biāo)準(zhǔn)差的形式表示，組間均數(shù)差異的顯著性比較采用單因素方差分析。 結(jié)果與討論 一、鄰苯二甲酸二丁酯和苯并(a)芘對大鼠生長發(fā)育及睪丸形態(tài)學(xué)的影響 1.對體重和臟器系數(shù)的影響 DBP單獨(dú)染毒、BaP單獨(dú)染毒以及DBP和BaP聯(lián)合染毒在本研究的染毒劑量下

8、未對大鼠一般生長發(fā)育情況和體重增長有明顯影響。對大鼠睪丸、心臟、脾臟無明顯毒性作用；1 mg/kg和5mg/kg BaP染毒60d可以使附睪系數(shù)比對照組下降；250mg/kg DBP染毒90d可升高肝臟系數(shù)，5mg/kg BaP染毒90d可降低肝臟系數(shù)；5mg/kg BaP染毒30d，以及50m/kg DBP+1mg/kg BaP低劑量聯(lián)合染毒30d都可使腎臟系數(shù)下降；250mg/kg DBP+5mg/kg BaP高劑量聯(lián)合染毒60d使

9、腎臟系數(shù)增高。提示BaP對附睪的影響更明顯，附睪可能是BaP的靶器官；肝臟、腎臟可能也是DBP和BaP的主要靶器官之一，DBP和BaP對肝、腎可能也有潛在毒性。 2.對睪丸及Leydig細(xì)胞形態(tài)學(xué)的影響 光鏡下未觀察到各染毒組睪丸形態(tài)有明顯病理改變；電鏡下各染毒組染毒90d均可引起大鼠睪丸Leydig細(xì)胞超微結(jié)構(gòu)發(fā)生不同程度的變化，主要是線粒體、滑面內(nèi)質(zhì)網(wǎng)擴(kuò)張，也可見核周隙增寬，髓樣變，核固縮，染色質(zhì)邊集，細(xì)胞器固縮，密

10、度增高，線粒體固縮。 二、鄰苯二甲酸二丁酯和苯并(a)芘對Leydig細(xì)胞激素合成的影響 1.對血清睪酮的影響 50mg/kg DBP染毒30d可升高血清睪酮含量，推測低劑量DBP染毒可能存在低劑量興奮效應(yīng)；1 mg/kg BaP染毒60d、5mg/kg BaP染毒30d-60d、50mg/kg DBP+1mg/kg BaP低劑量聯(lián)合染毒30d可升高血清睪酮含量。提示≤5mg/kg BaP染毒30d-60d可以干

11、擾睪酮的合成，可能BaP在此染毒劑量也有低劑量興奮效應(yīng)。 2.對睪丸Insl3 mRNA表達(dá)的影響 高、低劑量DBP和BaP單獨(dú)染毒以及聯(lián)合染毒30d、60d、90d都能使睪丸Insl3mRNA的表達(dá)下降。提示轉(zhuǎn)錄水平的Insl3比睪酮對低劑量DBP和BaP更敏感，青春期亞慢性暴露于低劑量DBP和BaP可影響Leydig細(xì)胞的功能。見表2。 三、鄰苯二甲酸二丁酯和苯并(a)芘對Leyqdig細(xì)胞睪酮合成的影響機(jī)制

12、探討 DBP和BaP單獨(dú)染毒以及聯(lián)合染毒30d、60d、90d對膽固醇跨膜轉(zhuǎn)運(yùn)調(diào)節(jié)因子、睪酮合成關(guān)鍵酶、睪酮合成分泌調(diào)節(jié)激素受體、以及相關(guān)的調(diào)節(jié)因子在轉(zhuǎn)錄水平或翻譯水平的影響結(jié)果總結(jié)于表3。 1.對膽固醇跨膜轉(zhuǎn)運(yùn)調(diào)節(jié)因子的影響 DBP和BaP單獨(dú)染毒以及低劑量聯(lián)合染毒60d對PBR基因表達(dá)的影響主要是下調(diào)；高劑量聯(lián)合染毒60d都是增強(qiáng)PBR的基因表達(dá)。提示DBP和BaP單獨(dú)以及聯(lián)合染毒都對PBR的基因表達(dá)有影

13、響，但是60d睪酮升高可能與PBR的上調(diào)或下調(diào)無關(guān)。 DBP和BaP染毒60d使StAR蛋白表達(dá)增強(qiáng)，與睪酮水平升高一致，提示StAR蛋白表達(dá)升高可能在睪酮升高中發(fā)揮作用，是致睪酮升高的可能機(jī)制之一。 2.對睪酮合成關(guān)鍵酶的影響 DBP和BaP單獨(dú)染毒以及聯(lián)合染毒60d對P450scc蛋白表達(dá)的影響無統(tǒng)計學(xué)意義。提示睪酮升高可能與P450scc蛋白無關(guān)。 5mg/kg BaP單獨(dú)染毒30 d使3β-H

14、SD蛋白表達(dá)增高，提示3β-HSD可能與5mg/kg BaP染毒30 d睪酮升高有關(guān)。 250mg/kg DBP染毒60d可使17β-HSD蛋白表達(dá)升高；1mg/kg BaP染毒90d使其下調(diào)。提示BaP染毒30 d引起睪酮升高可能沒有17β-HSD的參與。 3.對激素受體和相關(guān)調(diào)節(jié)因子的影響 DBP和BaP單獨(dú)染毒以及聯(lián)合染毒都可使LHR mRNA表達(dá)下降(P<0.01)；提示LHR在轉(zhuǎn)錄水平對DBP和BaP

15、的毒性敏感，但是LHR基因表達(dá)的下降可能并非染毒60d血清睪酮升高的原因，DBP和BaP對睪酮的影響與受體調(diào)節(jié)途徑無關(guān)，可能有非依賴LH通路的作用。 50mg/kg DBP和1mg/kg BaP染毒30d、60d都使TGFα蛋白表達(dá)增高(P<0.01)，5mg/kgBaP以及高、低劑量聯(lián)合染毒30d都上調(diào)TGFα蛋白表達(dá)(P<0.01)。提示睪酮升高與TGFα蛋白表達(dá)上調(diào)一致，推測可能BaP通過增加TGFα的表達(dá)來調(diào)節(jié)睪酮。

16、 染毒組對IGF-I蛋白表達(dá)的影響，30d、60d主要是上調(diào)(P<0.01；P<0.05)，90d時下調(diào)(P<0.01；P<0.05)。BaP組染毒60.IGF-I蛋白表達(dá)上調(diào)與睪酮升高一致，說明IGF-I蛋白表達(dá)上調(diào)可能是本研究中DBP或BaP導(dǎo)致睪酮升高的機(jī)制之一。 4.DBP和BaP高低劑量聯(lián)合染毒對各觀察指標(biāo)的聯(lián)合作用總結(jié)于表4。DBP和BaP聯(lián)合染毒可發(fā)生交互作用，主要表現(xiàn)為拮抗，其次是協(xié)同，少數(shù)呈現(xiàn)非交互作用-相

17、加。表4.DBP和BaP高低劑量聯(lián)合染毒的聯(lián)合作用結(jié)果總結(jié) 結(jié)論 亞慢性DBP和BaP單獨(dú)或聯(lián)合暴露可對青春期SD雄鼠產(chǎn)生不利影響，不同的染毒時間產(chǎn)生不同程度的有害效應(yīng)。BaP染毒可引起附睪、肝臟、腎臟系數(shù)改變，對這幾個器官有潛在毒性。BaP染毒60d可使睪酮升高，推測StAR、3β-HSD、TGFα、IGF-I蛋白的上調(diào)與其作用機(jī)制有關(guān)。50mg/kg DBP染毒60d升高血清睪酮，可能是DBP的低劑量興奮效應(yīng)，TGF