鄰苯二甲酸二丁酯對大鼠神經行為發(fā)育的影響及機制初探.pdf

1、鄰苯二甲酸二丁酯（Dibutyl phthalate，DBP）是目前用量較大的鄰苯二甲酸酯類（Phthalate esters，PAEs）化合物的重要成員，是一種重要的內分泌干擾物。DBP主要用作纖維素樹脂、聚氯乙烯、以及橡膠制品的增塑劑、軟化劑，同時也是生產油漆、粘接劑、藥物制劑等多種工業(yè)品的重要原料。在生產過程中，由于DBP并未與這些產品牢固結合，就會從中不斷釋放進入環(huán)境，對人群健康產生危害。
　　 據美國NTP估計，一般人

2、群通過各種途徑接受DBP的暴露水平為2-10 μg/kg體重/天。當DBP進入機體后，可迅速代謝為鄰苯二甲酸單丁酯（Mono-butyl phthalate，MBP），后者是DBP引起發(fā)育毒性效應的罪魁禍首。目前很多研究表明DBP的危害主要是其生殖和發(fā)育毒性。DBP的毒性機制主要源于其對內分泌的干擾作用，體內、體外實驗表明DBP具有雌激素和/或抗雄激素的活性，并能影響體內甾體合成的多種酶的活性。然而DBP對神經行為發(fā)育的影響目前尚不清楚

3、。
　　 中樞神經系統(tǒng)在發(fā)育時期對體內多種激素水平的變化非常敏感，若此期間暴露于內分泌干擾物DBP，其發(fā)育和功能很可能受到影響。流行病學資料提示DBP具有神經毒性，但由于是多種PAEs的混合暴露，其結果尚具有不確定性。神經行為指標不僅是反映內分泌干擾物對機體作用的敏感指標，也是化合物對多器官系統(tǒng)作用的綜合反映。本研究主要從神經行為發(fā)育的角度，對DBP的毒性作用及其機制進行初步探討，以進一步認識DBP的危害。
　　 研究以

4、大鼠為對象，通過在妊娠期和哺乳期染毒，采用一系列神經行為測試組合，在多個時間點測試DBP對F1大鼠神經行為發(fā)育的影響。多劑量組、大樣本、跨代長期染毒是本研究的特點。由于發(fā)現DBP可影響子代雄性大鼠的空間學習記憶，機制研究中以其為代表，采用分子生物學方法檢測在發(fā)育期間不同時間點仔鼠海馬中與學習記憶相關的基因和蛋白質的表達，采用電生理的方法檢測大鼠海馬齒狀回的長時程增強（long-term potentiation，LTP）能力的改變，初步

5、探討DBP對大鼠海馬神經細胞的發(fā)育和功能的影響，進一步了解DBP的神經毒性作用機制，為DBP污染的防治工作提供重要的實驗和理論依據。
　　 第一部分：DBP對F0雌性大鼠生殖和F1仔鼠生長發(fā)育的影響
　　 目的：研究DBP對F0雌性大鼠生殖和F1仔鼠生長發(fā)育的影響。
　　 方法：Wistar妊娠大鼠60只，隨機分為對照、低、次低、次高、高5個劑量組，每組11～13只。從GD6起，四個實驗組分別喂飼給予質量百分比含

6、量為0.037%、0.111%、0.333%和1%的DBP染毒孕、母鼠及F1仔鼠至PND28，對照組飼料不含DBP。觀察孕鼠的體重、進食量、染毒后的一般情況以及生殖情況；觀察測量仔鼠的體重變化、早期生理發(fā)育指標（體長、尾長、肛殖距、張耳、出牙、開眼）；染毒結束時解剖檢查各主要臟器情況并稱量計算臟器系數。
　　 結果：(1)各實驗組孕鼠的進食量和體重隨妊娠天數逐漸增加，但與對照組比較，其增量未見明顯改變（p>0.05）。(2)各實

7、驗組孕鼠未見明顯中毒癥狀，妊娠失敗率、每窩活仔數、窩仔性別比與對照相比無明顯差異（p>0.05），但高劑量組的妊娠期較對照組稍延長（p<0.05）。(3)高劑量組雌性和雄性仔鼠在PND0～28期間體重明顯低于對照組的同性別仔鼠，差異有顯著性（p<0.01）。(4)高劑量組雄性仔鼠的肛殖距（體重立方根標準化）顯著降低（p<0.01），而各劑量組雌性仔鼠肛殖距未見明顯改變（p>0.05）。(5)各實驗組仔鼠的張耳、出牙和開眼的天齡與對照組比

8、較無顯著差異（p>0.05）。(6)PND28齡高劑量組仔鼠（雌和雄）肝臟系數顯著增加（p<0.01），高、次高劑量組雌性仔鼠脾臟系數和高劑量組雄性仔鼠睪丸系數顯著降低（p<0.01），各實驗組腦、心、肺、腎和子宮臟器系數未見明顯改變（p>0.05）。
　　 結論：在本實驗的染毒方式、時間和劑量下，未見DBP對F0雌鼠的生殖能力產生明顯的毒性作用，但高劑量DBP顯著影響F1仔鼠的生長發(fā)育并具有明顯的臟器毒性，主要表現仔鼠體重減輕

9、、肛殖距（雄）縮短、肝臟脾臟和睪丸的臟器系數的改變。
　　 第二部分：DBP對F1大鼠神經行為發(fā)育的影響
　　 目的：研究DBP暴露對F1大鼠神經行為發(fā)育的影響。
　　 方法：孕鼠、仔鼠的分組染毒同第一部分。在出生后特定的天齡，每窩選擇仔鼠進行平面翻正（PND4，7）、負趨地性（PND4，7）、懸崖回避（PND7）、前肢懸掛（PND10）、空中翻正（PND16）等行為功能測試，檢測DBP對早期行為發(fā)育的影響；選擇

10、4周齡仔鼠進行開闊場實驗，檢測DBP對仔鼠活動度的影響；選擇5周齡仔鼠進行Morris水迷宮實驗，檢測DBP對F1仔鼠學習記憶能力的影響。
　　 結果：(1)早期行為發(fā)育指標：PND7高劑量組雄性仔鼠平面翻正的評分顯著低于對照組，差異有顯著性（p<0.05），高劑量和低劑量組雄性仔鼠PND10前肢懸掛時間較對照組顯著降低（p<0.05），但在PND4的平面翻正以及各時間點的懸崖回避、負趨地性和空中翻正試驗中不論是雄性還是雌性仔鼠

11、都未見有顯著的影響。(2)開闊場實驗：各實驗組仔鼠的跨格子數、跨格的分布、后腿站立次數以及停留超過0.5s的次數比較，既無處理效應的差異也無性別效應的差異（p>0.05），合并性別比較也未見統(tǒng)計學顯著的差異（p>0.05）。(3)Morris水迷宮實驗：①在隱蔽平臺試驗中，性別和訓練天數有明顯的交互作用（p<0.01），高劑量組的雄性仔鼠在訓練的第3-5天顯示比對照組較好的空間學習能力（p<0.05），但低劑量組雄性仔鼠在訓練的第4-5

12、天顯示比對照組較差的空間學習能力（p<0.05）；各實驗組雌性仔鼠的學習能力與對照組比較無顯著改變。②在空間探索試驗中，低劑量組和次低劑量組雄性仔鼠的空間偏好（反映空間記憶）顯著低于對照組（p<0.05）；各實驗組雌性仔鼠的空間偏好與對照組比較無顯著改變。③可視平臺試驗：各實驗組仔鼠（雄性和雌性）的逃避潛伏期和游泳路程與對照比較差異都無顯著性（p>0.05）。
　　 結論：在本實驗條件下，DBP暴露對F1雄性大鼠的早期神經行為發(fā)

13、育以及空間學習記憶有一定的影響，但對F1雌性大鼠的影響卻很少，其作用表現出明顯的性別差異和非單調的劑量-反應關系。
　　 第三部分：DBP對雄性仔鼠海馬神經細胞發(fā)育有關的基因和蛋白質表達的影響
　　 目的：研究DBP對雄性大鼠海馬神經細胞發(fā)育相關的基因和蛋白質表達的影響，探討DBP的神經毒性作用機制。
　　 方法：妊娠Wistar大鼠，隨機分為對照、低、次低、次高、高5個劑量組，每組8～10只。自GD6起，每日灌

14、胃給予玉米油（溶劑）、25mg/kg，75 mg/kg、225 mg/kg、675mg/kg的DBP染毒孕、母鼠至PND21；取PND1，7，21雄性仔鼠的海馬，用熒光定量RT-PCR檢測c-fos、BDNF (all variants)、Spinophilin、PSD95、Synaptophysin、CREST、BDNF variant Ⅲ等基因的表達；用Western blot檢測PND21雄性仔鼠海馬BDNF、p-CREB、Spi

15、nophilin和芳香化酶蛋白質的表達。
　　 結論：妊娠期和哺乳期高劑量的DBP暴露可促進雄性仔鼠海馬BDNF、Spinophilin和芳香化酶的表達，提示其可能促進海馬神經細胞的生長與分化、樹突棘增多；高劑量DBP暴露促進BDNF表達的作用與上游CREB的激活調控作用無關；DBP暴露可能不會影響雄性大鼠海馬的突觸結構和功能。
　　 第四部分：DBP對雄性大鼠成年后學習記憶以及血清生化指標和海馬LTP的影響
　　

16、 目的：研究發(fā)育期間DBP暴露對雄性大鼠成年后學習記憶的影響，研究DBP長期暴露對雄性大鼠血清生化指標和海馬齒狀回LTP的影響。
　　 方法：第3部分中的剩余雄性大鼠，1只/窩/組，繼續(xù)以同樣的方式和劑量染毒至PND28，在1月齡和2月齡時進行Morris水迷宮實驗；保留高劑量組、低劑量組和對照組繼續(xù)染毒至3月齡，尾尖采血檢測生化指標，在體測定海馬齒狀回LTP。
　　 結論：高劑量DBP染毒的雄性大鼠在近成年時仍然表現

17、出較好的學習記憶能力，可能是源于早期DBP對神經系統(tǒng)發(fā)育的影響；高劑量DBP長期暴露對成年雄性大鼠有明顯的肝臟毒性；DBP長期暴露對雄性大鼠海馬齒狀回顆粒細胞的突觸傳遞功能影響不明顯。
　　 綜上4個部分研究所述，在本實驗的研究條件下，發(fā)現高劑量的DBP具有明顯的生殖毒性、發(fā)育毒性和肝臟毒性。對早期神經行為而言，DBP對雌性仔鼠的影響不明顯，但對雄性仔鼠有一定的影響，表現為平面翻正、前肢懸掛等行為功能的異常。然而在高劑量時卻促進