鄰苯二甲酸二乙基已酯(DEHP)對(duì)小鼠神經(jīng)行為發(fā)育的影響及其機(jī)制研究.pdf

1、增塑劑鄰苯二甲酸二乙基己酯(di-(2-ethyl hexyl)phthalate，DEHP)是一種具有弱雌激素和抗雄性激素的活性的環(huán)境內(nèi)分泌干擾物，它對(duì)野生動(dòng)物和人類的生殖發(fā)育毒性已引起廣泛關(guān)注，但人們對(duì)DEHP的神經(jīng)發(fā)育毒性還缺乏認(rèn)識(shí)。研究發(fā)現(xiàn)圍生期DEHP暴露性別特異性地改變子代大鼠下丘腦視前區(qū)芳香酶活性而影響雌激素合成，生命早期暴露于低劑量的DEHP使得雄性大鼠仔鼠血清睪酮顯著下降。體外培養(yǎng)的肝細(xì)胞DEHP顯示出雌激素的效應(yīng)。以

2、往體外研究也表明，根據(jù)濃度不同，DEHP既可以激活ER而表現(xiàn)出雌激素效應(yīng)，也可以拮抗17β-雌二醇與ER的結(jié)合而表現(xiàn)出抗雌激素效應(yīng)。從而干擾人和動(dòng)物的內(nèi)分泌系統(tǒng)。
　　DEHP及其代謝物具有弱雌激素樣活性，可干擾體內(nèi)雌激素和雄激素的正?；顒?dòng)，且由于DEHP的初級(jí)代謝產(chǎn)物MEHP能夠穿過胎盤屏障及進(jìn)入母乳，其毒性作用在妊娠期和哺乳期就可以表現(xiàn)出來，可影響性激素敏感組織的發(fā)育和長期功能。然而性激素不僅調(diào)節(jié)機(jī)體的生殖發(fā)育，研究表明，妊娠

3、期和新生兒期大腦的發(fā)育和完善對(duì)雌激素樣活性物質(zhì)特別敏感。特別是海馬，研究表明海馬既是DEHP敏感的腦區(qū)也是與行為密切相關(guān)的腦區(qū)。
　　雌激素可通過雌激素受體β（ERβ）調(diào)節(jié)腦發(fā)育和再生密切相關(guān)的過程（如突觸的形成，樹突的延伸和分支，神經(jīng)遞質(zhì)和神經(jīng)肽的合成）;能夠在幾分鐘內(nèi)快速誘導(dǎo)多種腦內(nèi)細(xì)胞產(chǎn)生效應(yīng)，迅速激活多種激酶，如快速激活ERK1/2，進(jìn)而影響ERK1/2信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑參與的LTP形成及學(xué)習(xí)、記憶等認(rèn)知功能。研究表明雌激素的抗

4、焦慮作用是通過ERβ介導(dǎo)的。此外有報(bào)道睪酮及5α-二氫睪酮能夠減少嚙齒類動(dòng)物的焦慮樣行為。剛出生的雄性幼鼠給予雄激素受體(AR)拮抗劑氟他胺結(jié)果發(fā)現(xiàn)青春前期在強(qiáng)迫游泳和蔗糖偏好測試中抑郁樣行為增加，對(duì)抑郁行為的影響伴隨著海馬神經(jīng)發(fā)生和樹突棘的下降。NMDA受體為所有興奮性突觸的突觸后必需組份，是腦內(nèi)最重要的興奮性氨基酸受體，參與調(diào)節(jié)神經(jīng)元遷移、樹突和軸突發(fā)育、突觸形成與可塑性、學(xué)習(xí)記憶等活動(dòng)。此外鑒于谷氨酸能遞質(zhì)系統(tǒng)與焦慮和抑郁行為密切

5、相關(guān)，我們設(shè)想DEHP暴露影響學(xué)習(xí)記憶、焦慮和抑郁樣行為可能與海馬的谷氨酸遞質(zhì)系統(tǒng)、雌、雄激素及其受體有關(guān)，ERK1/2信號(hào)通路也可能參與了這一過程的調(diào)節(jié)。
　　研究內(nèi)容:
　　圍生期（妊娠期及哺乳期）母鼠DEHP暴露對(duì)青春期及成年期仔鼠的活動(dòng)性、探究、焦慮、抑郁、空間記憶行為的影響;圍生期DEHP暴露對(duì)小鼠血清睪酮和雌二醇含量的變化的影響;DEHP暴露對(duì)MDNA受體NR2B亞基及ERK1/2磷酸化水平(P-ERK1/2)和

6、雌激素受體（ERβ）和雄雌激素受體(AR)表達(dá)的影響。
　　方法:
　　母鼠從妊娠第7天至斷乳前（產(chǎn)后21天）進(jìn)行DEHP(10、50、200mg/kg/day)灌胃染毒，同時(shí)設(shè)空白對(duì)照組及溶媒對(duì)照組。仔鼠出生后第6周和第12周時(shí)每個(gè)劑量組分別采用曠場、高架十字迷宮、強(qiáng)迫游泳和Moms水迷宮等模型檢測DEHP對(duì)仔鼠的活動(dòng)性、探究、焦慮、抑郁、空間記憶行為的影響。分別選未進(jìn)行行為測試的6周及12周小鼠，按要求取海馬，Weste

7、rn blot檢測NMDA受體NR2B亞基，ERK1/2及ERK1/2磷酸化水平，雌激素受體β(ERβ)、雄激素受體(AR)蛋白的表達(dá)。放射免疫法檢測雌性小鼠血清中雌二醇的含量以及雄性小鼠血清中睪酮的含量。
　　結(jié)果:
　　1.圍生期10～200mg/kg/day DEHP，暴露不影響母鼠的產(chǎn)仔數(shù)及各組仔鼠出生第3天的體長。沒有明顯改變6周雄性仔鼠的體重及6周齡雄性仔鼠的睪丸系數(shù)，顯著增加10mg/kg/day和200mg/

8、kg/day雌性仔鼠的體重(p＜0.001);12周齡仔鼠中僅50mg/kg/day雄性仔鼠觀察到體重顯著增加（p＜0.05）。兩個(gè)時(shí)期所有劑量組動(dòng)物生殖器系數(shù)均沒有明顯改變。
　　2.血清激素水平檢測發(fā)現(xiàn)10～200mg/kg/day范圍的低水平DEHP暴露使得仔鼠的激素水平在一定程度上下降，但是與對(duì)照組相比均沒有顯著性。
　　3.行為檢測結(jié)果:
　　1)曠場行為檢測發(fā)現(xiàn)，圍生期DEHP暴露對(duì)青春動(dòng)物的影響表現(xiàn)為20

9、0mg/kg/day的DEHP顯著增加雄鼠的理毛次數(shù)（p＜0.05），而10、200mg/kg/day的DEHP顯著減少了雌性仔鼠的站立次數(shù)(p＜0.01;p＜0.05)，并因此消除理毛和站立行為的性別差異。圍生期DEHP暴露主要影響成年期雌性仔鼠的開場行為，10mg/kg/day的DEHP顯著增加雌鼠的理毛次數(shù)（p＜0.01)，10、200 mg/kg/day的DEHP減少雌鼠的3min跑格數(shù)（p＜0.05)。結(jié)果表明圍生期DEHP暴

10、露可抑制成年期雌性動(dòng)物活動(dòng)性，對(duì)其矛盾沖突心理影響加大，但對(duì)雄性的影響較小。以上結(jié)果表明，圍生期DEHP暴露可抑制青春期和成年后雌性仔鼠的探究意愿和活動(dòng)性，增加青春期雄性仔鼠和成年后雌性仔鼠的矛盾沖突心理。
　　2)高架十字迷宮行為檢測發(fā)現(xiàn)，圍生期DEHP暴露對(duì)仔鼠焦慮樣行為僅在青春期影響顯著，表現(xiàn)為正常青春期仔鼠在高架十字迷宮中的多種行為均表現(xiàn)出性別差異，顯示出雌鼠有較高的活動(dòng)性(p＜0.05)、較低的焦慮狀態(tài)（p＜0.01)和

11、探究意愿（p＜0.05)。而圍生期DEHP暴露對(duì)仔鼠在開放臂的進(jìn)入次數(shù)和停留時(shí)間表現(xiàn)出性別特異性作用，即10、200mg/kg/day DEHP抑制雌鼠在開放臂的進(jìn)入次數(shù)（p＜0.001)和停留時(shí)間（p＜0.01，p＜0.05)，而雄鼠僅200mg/kg/day DEHP暴露組開放臂的進(jìn)入次數(shù)減少(p＜0.01），而10、50mg/kg/day組停留時(shí)間百分比顯著減少（p＜0.01，p＜0.001)，同時(shí)消除了性別差異，促進(jìn)雌、雄性仔鼠

12、的焦慮樣狀態(tài)。以上結(jié)果表明，圍生期DEHP暴露可誘發(fā)青春期動(dòng)物焦慮樣行為，然而對(duì)成年期動(dòng)物無顯著影響。
　　3)水迷宮行為檢測發(fā)現(xiàn)圍生期DEHP暴露主要影響6周齡雄鼠的水迷宮行為，對(duì)成年后（12周）雌雄仔鼠的行為沒有顯著作用。與溶媒對(duì)照組相比，50和200mg/kg/day DEHP顯著延長了6周雄鼠在第3天和第4天航行訓(xùn)練中搜索平臺(tái)的潛伏期(p＜0.05和p＜0.05)，50 mg/kg/day DEHP顯著減少6周齡雄鼠在目標(biāo)

13、象限停留時(shí)間(p＜0.05)。以上結(jié)果提示圍生期DEHP暴露主要損傷青春期雄鼠仔鼠的空間學(xué)習(xí)記憶。
　　4)強(qiáng)迫游泳行為檢測發(fā)現(xiàn)，圍生期DEHP暴露對(duì)青春期及成年期雌雄性動(dòng)物均有顯著影響，然而青春期雄性兩個(gè)劑量組觀察到抑郁樣行為增加，而成年期僅一個(gè)劑量組觀察到，因而與其他模型結(jié)果相似的是成年期影響程度較青春低。4.進(jìn)一步的Western blot分析顯示，圍生期DEHP暴露顯著下調(diào)了青春期雄性仔鼠海馬NMDA受體NR2B亞基的表達(dá)

14、，而對(duì)雌性及成年期雌雄仔鼠的表達(dá)沒有影響。雌激素受體β(ERβ)在青春期和成年期的表達(dá)影響不一致，下調(diào)了6周雌雄仔鼠和12周仔鼠雌激素β受體（ERβ）的表達(dá);此外抑制6周齡雌雄仔鼠而對(duì)12周齡雌雄仔鼠海馬腦區(qū)AR的表達(dá)無顯著。抑制6周雌雄仔鼠ERK1/2的磷酸化水平，對(duì)12周雌雄仔鼠ERK1/2的磷酸化水平無顯著影響。
　　結(jié)論:圍生期DEHP暴露可影響子代小鼠青春期和成年期的多種行為及行為的性別差異，不同行為對(duì)DEHP的敏感程度