SCGE-HepG2測(cè)試系統(tǒng)在飲用水消毒副產(chǎn)物遺傳毒性評(píng)價(jià)中的應(yīng)用研究.pdf

1、飲用水消毒是保證城市供水安全的的重要步驟，但飲用水在消毒過(guò)程中會(huì)產(chǎn)生大量消毒副產(chǎn)物（disinfection by-products，DBPs）。研究表明，一些DBPs具有明顯的致突變性和遺傳毒性，或者致癌性。至今已發(fā)現(xiàn)的DBPs超過(guò)600種，除了氯消毒會(huì)生成DBPs，采用臭氧、氯胺、二氧化氯等消毒方式也會(huì)產(chǎn)生大量DBPs。在日常生活中，人群對(duì)DBPs的暴露呈現(xiàn)長(zhǎng)期性、暴露方式多樣性、多種DBPs混合暴露的特點(diǎn)。運(yùn)用流行病學(xué)或者慢性哺乳

2、動(dòng)物致癌試驗(yàn)等方法，評(píng)價(jià)眾多DBPs混合暴露對(duì)人群健康的影響，在現(xiàn)有的技術(shù)條件下還難以實(shí)現(xiàn)。因此，構(gòu)建一套短期遺傳毒理學(xué)試驗(yàn)檢測(cè)體系，對(duì)飲用水中DBPs混合暴露的遺傳毒性進(jìn)行快速、準(zhǔn)確的評(píng)價(jià)具有重要的現(xiàn)實(shí)意義。
　　 目的：以單細(xì)胞凝膠電泳試驗(yàn)（single cell gel electrophoresis assay，SCGE）為核心技術(shù)，以人類(lèi)來(lái)源的肝腫瘤細(xì)胞（human-derived hepatoma line，HepG

3、2）為靶細(xì)胞，組成SCGE/HepG2測(cè)試系統(tǒng)，對(duì)飲用水中普遍存在且對(duì)人類(lèi)健康威脅較大的5類(lèi)共15種DBPs的遺傳毒性進(jìn)行分析和比較，評(píng)估該測(cè)試系統(tǒng)的檢驗(yàn)效能和敏感性；運(yùn)用SCGE/HepG2測(cè)試系統(tǒng)對(duì)氯化消毒前后水樣提取物的遺傳毒性特征及影響因素進(jìn)行評(píng)價(jià)分析；探討該測(cè)試系統(tǒng)在飲用水安全性評(píng)價(jià)體系中的可行性，為其納入飲用水安全評(píng)價(jià)體系提供實(shí)驗(yàn)依據(jù)；應(yīng)用SCGE/HepG2測(cè)試系統(tǒng)結(jié)合氧化損傷標(biāo)志，探討DBPs引起靶細(xì)胞遺傳毒性損傷的機(jī)制

4、。
　　 方法：
　　 1、應(yīng)用SCGE/HepG2測(cè)試系統(tǒng)檢測(cè)15種DBPs對(duì)HepG2細(xì)胞DNA損傷的作用。15種DPBs包括4種三鹵甲烷、6種鹵乙酸、3種鹵乙腈、1種呋喃酮和1種醛類(lèi)。每種DBP均設(shè)計(jì)5個(gè)染毒劑量，染毒劑量范圍為0.001-10000μmol/l，同時(shí)設(shè)溶劑對(duì)照、陽(yáng)性對(duì)照和空白對(duì)照。染毒時(shí)間均為4小時(shí)。采集細(xì)胞DNA遷移圖，應(yīng)用CASP軟件分析采集的圖像，尾部DNA含量、尾長(zhǎng)和Oliver尾矩值作為

5、判斷細(xì)胞DNA損傷強(qiáng)度的指標(biāo)。
　　 2、應(yīng)用SCGE/HepG2測(cè)試系統(tǒng)評(píng)價(jià)水體樣本的遺傳毒性效應(yīng)。分別于2009年的枯水期和豐水期，采集武漢市以長(zhǎng)江和漢江為水源的兩個(gè)水廠的原水、經(jīng)氯化消毒處理后的出廠水以及管網(wǎng)末梢水。采用XAD-2大孔樹(shù)脂對(duì)水樣進(jìn)行濃縮提取。應(yīng)用SCGE/HepG2測(cè)試系統(tǒng)分析水樣提取物的遺傳毒性效應(yīng)，同時(shí)分析水中DBPs的含量。水樣提取物設(shè)為4個(gè)染毒濃度，分別相當(dāng)于1.2、6、30及150ml水樣/ml培

6、養(yǎng)液，染毒時(shí)間為24小時(shí)。水中DBPs含量分析采用頂空毛細(xì)管柱氣相色譜法。
　　 3、SCGE/HepG2測(cè)試系統(tǒng)結(jié)合氧化損傷標(biāo)志探討DBPs的遺傳學(xué)損傷機(jī)制。選擇消毒副產(chǎn)物水合氯醛（chloral hydrate，CH）為目標(biāo)物，采用慢性細(xì)胞毒性試驗(yàn)，檢測(cè)CH致HepG2的細(xì)胞毒性，計(jì)算細(xì)胞毒性潛力值。在含有或者不含抗氧化劑過(guò)氧化氫酶（Catalase）/或丁基羥胺茴香醚（Butyl hydroxylamine Anisole

7、，BHA）的條件下，用SCGE/HepG2測(cè)試系統(tǒng)檢測(cè)CH對(duì)HepG2細(xì)胞的遺傳學(xué)損傷效應(yīng)。測(cè)定CH染毒后的細(xì)胞內(nèi)活性氧（Reactive Oxygen Species，ROS）、丙二醛（Malondialdehyde，MDA）、超氧化物歧化酶（Superoxide Dismutase，SOD）和還原型谷胱甘肽（Glutathione，GSH）的含量；CH染毒系列分別為7.8125、15.625、31.25、62.5、125、250、5

8、00和1000μmol/l；染毒時(shí)間分別為4和24小時(shí)。
　　 結(jié)果：
　　 第一部分結(jié)果：根據(jù)引起HepG2細(xì)胞DNA明顯損傷的最低濃度，將DBPs遺傳毒性的強(qiáng)弱按類(lèi)別排序如下：①4種三鹵甲烷：一溴二氯甲烷（bromodichloromethane，BDCM）>一氯二溴甲烷（dibromochloromethane，DBCM）>溴仿（tribromomethane，TBM）>氯仿（trichloromethane，TC

9、M）；②6種鹵乙酸：碘乙酸（iodoacetic acid，IA）>溴乙酸（bromoacetic acid，BA）>二溴乙酸（dibromoacetic acid，DBA）>二氯乙酸（dichloracetic acid，DCA）>三氯乙酸（trichloroacetic acid，TCA），氯乙酸（chloroacetic acid，CA）無(wú)明顯的DNA損傷作用；③3種鹵乙腈：二溴乙腈（dibromoacetonitrile，DBN

10、）≈二氯乙腈（dichloroacetonitrile，DCN）>三氯乙腈（trichloroacetonitrile，TCN）；④屬于呋喃類(lèi)的3-氯-4-二氯甲基-5-羥基-2(5氫)-呋喃酮（3-chloro-4-(dichloromethyl)-5-hydroxy-2(5H)-furanone，MX）≈ TCA；⑤而屬于醛類(lèi)的CH ≈ DCA。在15種DBPs中，鹵乙酸類(lèi)的IA對(duì)細(xì)胞DNA的損傷作用最強(qiáng)，BA次之。SCGE/Hep

11、G2測(cè)試系統(tǒng)可檢測(cè)出14/15種DBPs的遺傳毒性，僅鹵乙酸類(lèi)的CA在測(cè)試系統(tǒng)中未顯示出遺傳毒性。
　　 第二部分結(jié)果：①漢江、長(zhǎng)江水樣中均檢出TCM和BDCM，二者在消毒后水樣中的含量均高于原水，且在枯水期漢江水樣中的含量高于同期長(zhǎng)江水樣；②與溶劑對(duì)照相比，漢江水源原水、出廠水、管網(wǎng)末梢水提取物主要在中、高濃度時(shí)（30、150ml/ml）誘導(dǎo)HepG2細(xì)胞DNA損傷明顯增加（P＜0.05或P＜0.01）；與同濃度原水相比，豐水

12、期漢江水源出廠水提取物在低、中、高濃度（6、30、150ml/ml），以及管網(wǎng)末梢水提取物在低濃度（1.2、6ml/ml），引起DNA損傷明顯增加；③與溶劑對(duì)照相比，長(zhǎng)江水源原水、出廠水和管網(wǎng)末梢水提取物主要在中、高濃度（30、150ml/ml）誘導(dǎo)HepG2細(xì)胞DNA損傷明顯增加（P＜0.05或P＜0.01）；與同濃度原水相比，枯水期長(zhǎng)江水源出廠水提取物和豐水期管網(wǎng)末梢水提取物在高濃度（150ml/ml），引起DNA損傷明顯增加（P＜

13、0.05或P＜0.01）；④不論是漢江水源還是長(zhǎng)江水源，枯水期水樣提取物誘導(dǎo)的HepG2細(xì)胞OTM值均高于豐水期（P＜0.05或P＜0.01）；⑤不論是枯水期還是豐水期，漢江水源水樣提取物誘導(dǎo)的HepG2細(xì)胞OTM值均高于長(zhǎng)江水源（P<0.01）。
　　 第三部分結(jié)果：①消毒副產(chǎn)物CH引起HepG2細(xì)胞的％C1/2值為2.36×10-3 mol/l；②BHA或者Catalase單獨(dú)染毒均未引起HepG2細(xì)胞的DNA損傷，40 μ

14、mol/l的CH單獨(dú)染毒可使HepG2細(xì)胞的DNA損傷明顯增加。不同濃度的BHA或Catalase與40 μmol/l的CH聯(lián)合染毒時(shí)，DNA損傷較之CH單獨(dú)染毒明顯降低（P＜0.001）；③在染毒4小時(shí)的條件下，CH濃度達(dá)500μmol/l以上時(shí)，HepG2細(xì)胞內(nèi)ROS生成量明顯增加、GSH含量明顯下降（P＜0.05或P＜0.01），但MDA和SOD含量沒(méi)有明顯的影響；④在染毒24小時(shí)的條件下，CH濃度達(dá)125μmol/l以上時(shí)，He

15、pG2細(xì)胞內(nèi)ROS生成量明顯增加、GSH含量顯著下降（P＜0.05或P＜0.01）；高濃度的CH（1000μmol/l）可引起細(xì)胞內(nèi) MDA生成量上升和SOD含量下降（P＜0.05）；⑤相關(guān)分析表明，CH誘導(dǎo)的ROS含量的變化與GSH和SOD含量的變化呈負(fù)相關(guān)（P＜0.05或P＜0.01）、與MDA含量的變化呈正相關(guān)（P＜0.01）；GSH含量的變化與MDA含量變化呈負(fù)相關(guān)（P＜0.01）、與SOD含量變化呈正相關(guān)（P＜0.01）；MD

16、A含量的變化與SOD含量變化呈負(fù)相關(guān)（P＜0.01）。
　　 結(jié)論：
　　 （1）5類(lèi)共15種DBPs中，鹵乙酸類(lèi)對(duì)HepG2細(xì)胞的DNA損傷作用最強(qiáng)。DBPs對(duì)細(xì)胞DNA的損傷作用還因取代基而不同，碘代DBP的DNA損傷作用高于溴代DBP，溴代DBP對(duì)DNA的損傷作用則高于氯代DBP。
　　 （2）氯化消毒增加了地表水的遺傳毒性；水樣提取物的遺傳毒性受到水文期和水源因素的影響，枯水期水樣提取物遺傳毒性高于豐水期