枯草芽孢桿菌WY34產(chǎn)甘露聚糖酶及其激活劑性質(zhì)的研究.pdf

1、本文針對枯草芽孢桿菌(Bacillussubtilis)WY34所產(chǎn)甘露聚糖酶進(jìn)行了一系列研究，包括固體發(fā)酵條件的探討、蛋白純化及酶學(xué)性質(zhì)等，并第一次探討了該甘露聚糖酶激活蛋白的純化及其對該酶部分酶學(xué)性質(zhì)的影響。主要內(nèi)容和結(jié)論如下： 1.枯草芽孢桿菌WY34固體發(fā)酵產(chǎn)甘露聚糖酶的最佳培養(yǎng)條件為：麩皮5g，初始水分含量71％，初始pH7.0，接種量2mL，1％Tween-80，0.4g魔芋粉，培養(yǎng)溫度50℃。在最適條件下培養(yǎng)5d，

2、甘露聚糖酶酶活高達(dá)7650U/g干基，是未優(yōu)化前酶活的2.78倍，且該酶制劑僅有微弱的纖維素酶和木聚糖酶活力。 2.通過鹽析、凝膠過濾及離子交換層析，得到SDS-PAGE電泳純的甘露聚糖酶，經(jīng)PAS染色被證實為一糖蛋白，純化過程酶活回收率20.3％，純化倍數(shù)為5.4倍，分子量為39.6kDa。 3.對枯草芽孢桿菌WY34甘露聚糖酶的酶學(xué)性質(zhì)研究得出：該酶反應(yīng)的最適pH為6.0，在pH5.5-10.1范圍內(nèi)穩(wěn)定；反應(yīng)最適溫

3、度為65℃，在溫度不高于60℃條件下均比較穩(wěn)定。Mn2+、EDTA、Mg2+Ag+、β-巰基乙醇與SDS對該酶有強烈抑制作用，化學(xué)試劑N-bromosussinimide(NBS)則完全抑制了該酶活性；Fe2+和Co2+則對該酶有激活作用。該酶對不同底物都表現(xiàn)出一定的水解能力，其中以槐豆膠為底物時酶活力最高，魔芋粉次之，而對椰子甘露聚糖和瓜爾豆膠則相對酶活力較低。該酶對非甘露聚糖底物如淀粉、CMC(CarboxymethylCellul

4、ose-Na)、樺木木聚糖也有微弱活力。三種天然底物槐豆膠、精制魔芋粉及瓜爾豆膠的Km分別是7.6±0.2、10.5±0.6和27.4±2.5mg/mL。該酶對椰子甘露聚糖的水解產(chǎn)物主要是甘露四糖、甘露三糖和甘露二糖，而對槐豆膠則產(chǎn)生了一系列不同聚合度的甘露寡糖。該酶幾乎不能水解甘露三糖及甘露二糖，但能緩慢的水解甘露四糖。該酶水解甘露五糖產(chǎn)生甘露四糖、甘露三糖和甘露二糖。該酶對中性蛋白酶和胰蛋白酶的攻擊有一定的抵抗能力。 4.枯

5、草芽孢桿菌WY34產(chǎn)的甘露聚糖酶激活蛋白通過硫酸銨沉淀和DEAE-52離子交換層析兩步基本達(dá)到電泳純，純化倍數(shù)達(dá)18.4，回收率為25.9％。在SDS-PAGE上測得分子量為64.59kDa。 5.當(dāng)激活蛋白與枯草芽孢桿菌WY34甘露聚糖酶以2∶1(w/w)的比例混合時，甘露聚糖酶活最高，；37℃為該激活劑最適作用溫度：加入激活劑后，甘露聚糖酶最適溫度及其溫度穩(wěn)定性均沒有明顯變化，但其最適pH降低了0.5個單位，pH穩(wěn)定范圍拓寬