氯乙烯作業(yè)工人遺傳損傷與miRNA表達、凋亡基因突變.pdf

1、本研究利用較完整的車間VCM濃度監(jiān)測資料和VCM作業(yè)工人的詳細工作流程記錄對VCM作業(yè)工人累積接觸劑量進行較為精確的計算，通過健康體檢、遺傳損傷檢測和表觀遺傳損傷檢測指標來評估VCM累積接觸劑量與VCM作業(yè)工人健康損傷之間的關(guān)系，探討低濃度VCM暴露下的可能效應(yīng)生物標志;再者，通過凋亡相關(guān)基因突變位點頻率檢測，探討凋亡相關(guān)基因與VCM致遺傳損傷之間的關(guān)系，以期發(fā)現(xiàn)VCM致遺傳損傷可能的易感性生物標志。
　　本次研究對象包括VCM接

2、觸組397例（男性311名，女性86名），對照組143例（男性61名，女性82名），對上述研究對象進行問卷調(diào)查，內(nèi)容包括姓名、性別、年齡、體重、身高、文化程度等一般情況，吸煙狀況、飲酒狀況、生活習慣，家族遺傳病史，個人既往病史以及車間、工段、現(xiàn)工種工齡等職業(yè)史。并協(xié)助該廠2011年職工定期健康體檢，收集整理體檢項目資料包括血壓、心率、血紅蛋白、肝功能、B超檢查結(jié)果及相關(guān)癥狀和體征等。體檢結(jié)果顯示，接觸組工人血紅蛋白異常率低于對照組，而心

3、電圖異常率，血壓異常率和肝B超異常率均高于對照組;白細胞異常率和谷丙轉(zhuǎn)氨酶異常升高率未見統(tǒng)計學差異。雖然這些指標均不能作為VCM暴露致個體健康損傷的特異性指標，但仍是VCM作業(yè)工人的健康體檢中重要的項目，有助于醫(yī)學咨詢和開展健康促進。
　　本次研究利用胞質(zhì)分裂阻滯微核實驗(CBMN)法對VCM接觸組工人和對照組人群進行染色體損傷檢測，成功獲得342例接觸組和107例對照組工人的微核結(jié)果。結(jié)果顯示VCM接觸組的外周血淋巴細胞微核率(

4、2.26±2.07(‰))顯著高于對照組(1.18±1.56(‰))，F(xiàn)R值為1.92(95％CI:1.60，2.33)，p＜0.001。按照氯乙烯作業(yè)工人累積接觸劑量的四分位數(shù)將接觸組分為四個劑量組，分別是低劑量組(＜682.57mg)、中劑量組(～9072.1mg)、高劑量組(～31796mg)和超高劑量組(＞31796mg)，相對應(yīng)各組外周血淋巴細胞微核率分別為1.66±1.86(‰)、2.17±2.00(‰)、3.15±2.31

5、(‰)和2.04±1.82(‰)，與對照組(1.18±1.56(‰))比較，F(xiàn)R值分別為1.41(95％CI:1.11，1.79)，p=0.005，1.85(95％CI:1.48,2.32), p＜0.001,2.68(95％CI:2.17,3.32), p＜0.001和1.74(95％CI:1.38，2.19)，p＜0.001，微核率均顯著增加。接觸組中男性(2.04±1.92(‰))相比女性(2.95±2.37(‰))微核發(fā)生率低，

6、FR值為0.69(95％CI:0.59，0.80)，p＜0.001。年齡因素對微核率也存在影響，結(jié)果表明年齡≥40歲(2.51±2.09(‰))相比年齡＜40歲的工人(1.95±2.02(‰))，微核率均顯著增加，F(xiàn)R值為1.29(95％CI:1.12，1.49)，p=0.001。多因素Poisson回歸分析結(jié)果顯示VCM累積接觸劑量、年齡增長、女性是影響微核率的危險因素。進一步利用基準劑量(BMD)法分析微核率與VCM累積接觸劑量之間

7、的關(guān)系，結(jié)果顯示女性VCM接觸劑量的基準劑量95％可信區(qū)間下限(BMDL)為1.74g，遠低于總?cè)巳旱腂MDL值6.41g，提示女性相對男性仍是VCM致染色體損傷的危險因素，與上述結(jié)果一致。
　　同時，針對年齡，吸煙，飲酒等特征進行匹配，篩選出20名男性氯乙烯接觸工人，根據(jù)氯乙烯接觸劑量及遺傳損傷狀況分組，每組五人，包括低劑量非損傷組(L-N)，低劑量損傷組(L-I)，高劑量非損傷組(H-N)和高劑量損傷組(H-I)，利用micr

8、oRNA芯片技術(shù)和生物信息學方法，在國際上首次對氯乙烯接觸人群的差異miRNA進行分析篩選，結(jié)果顯示VCM高暴露組與VCM低暴露組中共發(fā)現(xiàn)15條miRNA分子表達水平改變，其中7條miRNA分子上調(diào)，8條miRNA分子下調(diào)，染色體損傷組與非損傷組中共發(fā)現(xiàn)72條miRNA分子表達水平改變，其中38條miRNA分子上調(diào)，34條miRNA分子下調(diào)。繼而利用實時熒光定量PCR法在另外20例氯乙烯接觸工人和5名對照人群中驗證其中部分miRNA分子

9、在兩組的表達水平是否存在差異。依據(jù)芯片結(jié)果和研究報道選取與DNA損傷反應(yīng)相關(guān)的7條miRNA分子進行驗證分析，分別為miRNA-22、miRNA-24、miRNA-222、miRNA-151b、miRNA-15a、miRNA-21和miRNA-34a，此類miRNA分子在DNA損傷反應(yīng)中表達水平發(fā)生改變，并可以通過調(diào)節(jié)它們的靶基因表達水平影響DNA損傷反應(yīng)。結(jié)果顯示其中4條miRNA表達結(jié)果與芯片基本一致。相比健康對照人群，VCM接觸工

10、人的miRNA-24，miRNA-22和miRNA-34a成上調(diào)狀態(tài)，miRNA-21則為下調(diào)狀態(tài)。其中miRNA-24表達水平上調(diào)最顯著(p＜0.01，F(xiàn)C=4.16)。本研究中miRNA-24、miRNA-22和miRNA-34a在VCM接觸工人中表達水平明顯升高，提示VCM接觸工人體內(nèi)細胞受到外源性化學毒物刺激后，該類miRNA分子表達水平升高，引起DNA損傷修復能力下降，促進凋亡，屬于抑癌因子。相反，miRNA-21為促癌因子，

11、其表達水平下降，能夠促進凋亡，去除體內(nèi)受損傷的細胞，從而阻礙細胞惡性增殖和腫瘤化。將雙核微核率＞3‰的個體定義為染色體損傷組，雙核微核率≤3‰的個體定義為染色體非損傷組。采用Mann-Whitney U test方法比較損傷組與非損傷組之間miRNA表達水平的差異是否具有統(tǒng)計學意義，未發(fā)現(xiàn)兩組miRNA表達水平存在顯著性差異，可能原因是樣本量較小。
　　最后利用限制性內(nèi)切酶片段長度多態(tài)性—聚合酶鏈反應(yīng)(PCR-RFLP)技術(shù)對34

12、2例接觸組和107例對照組人群的凋亡相關(guān)基因突變位點進行檢測，將外周血淋巴細胞雙核微核率作為染色體損傷的效應(yīng)指標，應(yīng)用多因素Poisson回歸分析和PHASE2.0.2軟件分析各凋亡相關(guān)基因突變位點及其雙體型與染色體損傷之間的關(guān)系。本次研究選擇了6個凋亡相關(guān)基因共12個常見突變位點，分別是p53intron3、p53139C＞T、p53119C＞G、p5362G＞A、Mdm2 De11518、Mdm2309T＞G、Fas670A＞G、F

13、as1377G＞A、FasL844C＞T、Bcl-2938C＞A、Bcl-2127G＞A、Bax248G＞A。多因素Poisson回歸分析結(jié)果顯示年齡，BMI，吸煙情況，累積接觸劑量，P53intron3雜合型，Mdm2T309G雜合型，BC l-2C938A突變純合型，BaxG248A雜合型可能為染色體損傷的影響因素。p53in tron3(WM)雜合型、Mdm2T309G(TG)雜合型和Bcl-2C938A(AA)突變純合型攜帶者的

14、染色體損傷風險均高于野生型個體(p＜0.05)，F(xiàn)R值分別為1.38(95％CI:1.05，1.79)，1.34(95％CI:1.08，1.67)和1.25(95％CI:1.01,1.56)。
　　采用SHEsis軟件進行連鎖不平衡檢驗，以連鎖不平衡系數(shù)D'作為判斷標準，D'＞0.7時為強連鎖不平衡。結(jié)果顯示p53intron3、p53139C＞T、p53119C＞G、p5362G＞A之間的D'值分別為0.998(p53intro

15、n3與119)、1.021(p53intron3與139)、1.000(p53intron3與62)、1.021(p53-62與139)、0.998(p53-62與119)和0.716(p53-119與139)，兩兩突變位點之間存在連鎖不平衡狀態(tài)。Mdm2 Del1518與Mdm2309T＞G之間的D'值為0.945，存在連鎖不平衡狀態(tài)。Fas670A＞G與Fas1377G＞A之間的D'值為0.966，存在連鎖不平衡狀態(tài)。本研究分別對P

16、53基因、Mdm2基因和Fas基因的雙體型與微核率之間的關(guān)系進行了單因素及多因素Poisson回歸分析。平衡了其他因素后，結(jié)果顯示，年齡和累積接觸劑量是微核率增加的危險因素。攜帶P53基因各突變雙體型的個體平均微核率與攜帶野生純合型雙體型的個體相比，差異均沒有統(tǒng)計學意義(p＞0.05)，但值得關(guān)注的是WCCG/MCCA雙體型，相比WCCG/WCCG野生純合型雙體型發(fā)生染色體風險增加了55％(FR=1.55，95％CI:0.95，2.41

17、，p=0.0662);攜帶Mdm2基因各突變雙體型的個體相比WT/WT野生純合型雙體型的個體染色體損傷的風險均降低，其中WT/MT突變雙體型的個體相比野生純合型雙體型的個體染色體損傷的風險降低了51％(FR=0.49，95％CI:0.33，0.74，p＜0.001)，WG/WG突變雙體型的個體相比野生純合型雙體型的個體染色體損傷的風險降低了27％(FR=0.73，95％CI:0.51，1.05，p=0.0861)。攜帶Fas基因各突變雙

18、體型的個體與攜帶野生純合型雙體型的個體之間的染色體損傷風險沒有顯著性差異。
　　綜上所述，在現(xiàn)階段VCM低濃度暴露水平下，綜合考慮遺傳因素，生活習慣等影響，VCM作業(yè)工人的微核率顯著增加，說明其具有潛在健康風險;某些miRNA分子表達水平改變與VCM接觸有關(guān)，但未發(fā)現(xiàn)其與VCM致染色體損傷之間的關(guān)系;同時，本次研究中發(fā)現(xiàn)的某些凋亡相關(guān)基因突變位點也為識別VCM致染色體損傷的易感人群提供了依據(jù)，應(yīng)在以后的工作中加強對這類人群健康的關(guān)