腸易激綜合征腦-腸交互作用模型結(jié)腸5-羥色胺、酪氨酸羥化酶水平變化及蛋白指紋圖譜初探.pdf

1、研究背景：腸易激綜合征(Irritable Bowel Syndrome，IBS)是一種常見的功能性腸病，其病因和發(fā)病機制并不清楚，目前公認IBS是多因素疾病。IBS病理生理學基礎(chǔ)是腸道動力異常和內(nèi)臟高敏感性。單胺類神經(jīng)遞質(zhì)5-羥色胺(5-HT)、去甲腎上腺素(NE)是腸神經(jīng)系統(tǒng)重要的神經(jīng)遞質(zhì)，參與腸道感覺、動力、分泌的調(diào)控。 本實驗室前期在腦-腸交互作用理論基礎(chǔ)上，建立了慢急性聯(lián)合應激IBS大鼠模型，即動物在接受慢性不可預知輕

2、度應激(CUMS)后接受一次急性束縛應激，已證實可從腸道動力、感覺和心理行為多方面模擬IBS表現(xiàn)，且具有穩(wěn)定與重復性好的特點。本研究在前期對5-HT與NE在IBS動物模型研究的基礎(chǔ)上，將應用慢急性聯(lián)合應激動物模型完善對5-HT與NE系統(tǒng)的研究并進行新的探索研究，整個研究分為三部分。 研究目的： 1、通過測定各組大鼠感覺傳導通路上脊髓背角、海馬、額葉等腦-腸軸層面神經(jīng)元c-fos水平，從分子水平評估慢急性聯(lián)合應激動物模型。

3、 2、完善與深入探討5-HT系統(tǒng)和NE系統(tǒng)在IBS的變化與可能的作用機制。 3、利用蛋白質(zhì)組學觀察IBS腦一腸交互作用動物模型結(jié)腸蛋白質(zhì)全景，初步探討IBS這一功能性腸病有無蛋白水平的變化。 材料與方法： 選用健康雄性成年Wistar大鼠，分為對照組、急性應激組(急性束縛1小時)、慢性應激組(CUMS，21天不可預知輕度應激)、慢急性聯(lián)合應激組(聯(lián)合應激組，CUMS的基礎(chǔ)上給予急性束縛應激)。觀察不同應激

4、狀態(tài)下的大鼠一定時間內(nèi)糖水攝取量、排便顆粒、直腸擴張時腹肌收縮次數(shù)的變化，對模型進行再評價。采用免疫組織化學方法檢測各組大鼠額葉、海馬、脊髓背角、結(jié)腸c-fos水平；免疫組織化學方法檢測各組大鼠結(jié)腸嗜鉻細胞(EC)，甲苯胺藍染色檢測大鼠結(jié)腸肥大細胞(MC)及活化肥大細胞百分比(活化MC％)；免疫組織雙染方法檢測各組大鼠結(jié)腸酪氨酸羥化酶(TH)及其活化程度；Western Blot方法檢測各組大鼠結(jié)腸TH蛋白水平；實時RT-PCR方法檢測

5、各組大鼠結(jié)腸和人類結(jié)腸粘膜TH-mRNA和c-fos-mRNA水平；MALDI-TOF-MS技術(shù)檢測各組大鼠結(jié)腸蛋白指紋圖譜。 結(jié)果： 1.聯(lián)合應激大鼠額葉、海馬、脊髓背角Fos蛋白明顯高于對照組(P=0.026，0.002，0.013)；結(jié)腸Fos蛋白略高于對照組(P=0.205)；而與慢性應激大鼠相近(P=0.733)。急性應激大鼠中樞(額葉、海馬、脊髓背角)與結(jié)腸c-los-mRNA、Fos蛋白與對照組亦無顯著差異

6、(P>0.05)。 2、聯(lián)合應激可使大鼠結(jié)腸分泌5-HT的EC和MC增多，MC活化脫顆粒，5-HT合成增加(P<0.05)，5-HT含量亦增多，但對結(jié)腸5-HT代謝的其他指標無顯著影響。急性應激組結(jié)腸MC無明顯變化，而脫顆粒MC％明顯升高，EC較對照組增多(P>0.05)；慢性應激組結(jié)腸EC、MC和脫顆粒MC％增多；結(jié)腸TPH1 mRNA明顯增高，結(jié)腸5-HT陽性細胞數(shù)增多(P<0.05)。 3、聯(lián)合應激大鼠結(jié)腸NE含量

7、顯著增高，TH蛋白、TH-mRNA有升高趨勢(P=0.590，0.363)；急性應激組結(jié)腸NE無明顯變化，TH蛋白、TH-mRNA有增高趨勢(P>0.05)；慢性應激大鼠結(jié)腸NE含量有減低趨勢，TH蛋白、TH-mRNA無明顯變化(P>0.05)。 4、結(jié)腸5-HT系統(tǒng)和TH間相關(guān)系數(shù)無統(tǒng)計學意義(P>0.05)。 5、腹瀉型IBS患者結(jié)腸粘膜TH和c-fos mRNA表達高于對照組(P=0.466，0.110)，便秘型I

8、BS患者結(jié)腸粘膜TH-mRNA低于IBS-D，而與對照組無明顯差異(P>0.05)。 6、聯(lián)合應激大鼠與對照組間有明顯差異(P<0.05)的蛋白質(zhì)/肽質(zhì)量差異峰18個，與慢性應激大鼠間有10個，與急性應激大鼠間有1個，全部為聯(lián)合應激組上調(diào)。各應激組之間的差異蛋白有一定重復性。 結(jié)論： 1、聯(lián)合應激大鼠腦一腸軸各層面尤其是脊髓背角、海馬Fos蛋白顯著升高，而單純急性應激模型Fos蛋白無明顯升高，提示慢急性聯(lián)合應激模

9、型不同于單純急性束縛應激模型，是可以部分模擬腦一腸交互作用的動物模型，為從分子水平研究IBS腦一腸交互作用提供平臺。 2、動物與人結(jié)腸標本研究顯示：慢性應激調(diào)動機體5-HT系統(tǒng)和NE系統(tǒng)處于活躍狀態(tài)，在此狀態(tài)下，5-HT系統(tǒng)和NE系統(tǒng)對新的急性應激的反應較正常增強， 5-HT和NE總量增多，前者通過抑制5-HT降解，后者則通過NE合成增加實現(xiàn)。在機體對慢急性聯(lián)合應激的反應中，腸道局部以5-HT系統(tǒng)作用為主導，NE系統(tǒng)則起輔助作用