巨噬細(xì)胞損傷和淋巴管形成障礙導(dǎo)致的糖尿病足部非缺血性潰瘍難愈合的機(jī)制研究.pdf

1、[背景]: 糖尿病足部潰瘍(diabeticfootulcer,DFC)作為糖尿病的慢性并發(fā)癥是導(dǎo)致截肢的主要原因之一。不僅給患者帶來(lái)巨大的精神壓力、嚴(yán)重地影響生活質(zhì)量，同時(shí)也造成了沉重的社會(huì)經(jīng)濟(jì)負(fù)擔(dān)。 以往的研究表明： (1)局部組織胰島素水平低下導(dǎo)致的創(chuàng)面組織細(xì)胞代謝異常； (2)創(chuàng)面局部炎癥反應(yīng)失調(diào)； (3)晚期糖基化產(chǎn)物(advancedglycationendproducts，AGEs)

2、引起的皮膚病理生理學(xué)改變；均與糖尿病足部潰瘍創(chuàng)面難愈合相關(guān)。 基于對(duì)以上已有研究的思考，本課題設(shè)計(jì)為三部分。 第一部分:糖尿病足部非缺血性潰瘍皮膚組織巨噬細(xì)胞數(shù)量及功能損傷和淋巴管形成障礙的研究 [目的]:觀察糖尿病足部非缺血性潰瘍周邊皮膚組織中巨噬細(xì)胞數(shù)量、分泌功能和淋巴管形成的情況，以及激活的巨噬細(xì)胞和淋巴管內(nèi)皮的關(guān)系，并與相同潰瘍形成時(shí)間的非糖尿病足部潰瘍皮膚、正常皮膚組織比較。 [方法]:

3、 1、以年齡、性別及潰瘍形成時(shí)間相匹配的糖尿病足部非缺血性潰瘍患者、非糖尿病足部潰瘍患者以及其潰瘍周邊皮膚作為研究對(duì)象，以正常皮膚組織作為對(duì)照，分別命名為糖尿病足潰瘍組(diabeticfootgroup，DF)、非糖尿病足潰瘍組(non-diabeticfootgroup，NDF)和正常對(duì)照組(normalcontrolgroup，NC)。 2、采用HE常規(guī)染色觀察三組皮膚組織學(xué)差異。 3、免疫組織化學(xué)方法檢測(cè)各組CD

4、68、VEGFR3、LYVE-1、VEGFC蛋白表達(dá)。 4、RT-PCR檢測(cè)各組CD68mRNA、VEGFR3mRNA、LYVE-1mRNA、VEGFCmRNA表達(dá)。 5、激光共聚焦顯微鏡檢測(cè)各組CD68表達(dá)和LYVE-1表達(dá)的關(guān)系。 [結(jié)果]: 1、NDF組、DF組和NC組比較，年齡無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P>0.05),NDF組和DF組比較，潰瘍形成時(shí)間無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P>0.05)。 2、組織學(xué)結(jié)果：D

5、F組皮膚組織及NDF組皮膚組織中均有典型的組織學(xué)改變，與正常皮膚清晰的表皮復(fù)層結(jié)構(gòu)、豐富且致密的膠原排列形成了鮮明的反差。 3、免疫組化結(jié)果： (1)CD68在NC組表皮組織中表達(dá)為陽(yáng)性，其陽(yáng)性細(xì)胞存在于表皮基底部。 (2)LYVE-1在NC組表皮組織表達(dá)陽(yáng)性，陽(yáng)性細(xì)胞集中在表皮基底部。 (3)VEGFR3在NC組表皮組織表達(dá)為陽(yáng)性，陽(yáng)性細(xì)胞主要集中在表皮組織基底部。 (4)VEGFC在NC組表皮

6、組織表達(dá)為陽(yáng)性，陽(yáng)性信號(hào)集中在表皮組織基底層。 4、RT-PCR結(jié)果：DF組和NC組、NDF組比較，CD68mRNA表達(dá)減少，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.001)；NDF組和NC組比較，CD68mRNA表達(dá)增加，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P<0.001)。 5、激光共聚焦顯微鏡結(jié)果顯示：NC組表皮組織基底層可見CD68陽(yáng)性細(xì)胞，在表皮組織、表皮組織與真皮組織交界部位可以見到LYVE-1陽(yáng)性信號(hào)，疊加后未見CD68和LYVE-1信號(hào)

7、重疊。 [結(jié)論]: 1、糖尿病足部非缺血性潰瘍和非糖尿病足潰瘍皮膚組織均存在表皮組織增厚，真皮組織變薄、真皮組織膠原減少、排列紊亂等。 2、相同潰瘍形成時(shí)間的糖尿病足部非缺血性潰瘍皮膚組織較非糖尿病足部潰瘍皮膚組織巨噬細(xì)胞數(shù)量減少，分泌VEGFC的功能降低，淋巴管內(nèi)皮形成減少。 3、非糖尿病足部潰瘍皮膚組織中激活的巨噬細(xì)胞能夠轉(zhuǎn)化為淋巴管內(nèi)皮細(xì)胞。 第二部分:糖尿病足部非缺血性潰瘍患者外周血白細(xì)胞

8、VEGFR3表達(dá)及VEGFR3+細(xì)胞數(shù)量變化的研究 [目的]:探討糖尿病足部非缺血性潰瘍患者、糖尿病患者外周血白細(xì)胞中VEGFR3表達(dá)和VEGFR3+細(xì)胞(淋巴管內(nèi)皮祖細(xì)胞)數(shù)量的改變以及其可能的影響因素。 [方法]: 1、分為糖尿病足部潰瘍組(DF組)、糖尿病1組(DM1組，HbAlC<7％)、糖尿病2組(DM2組，HbAlC37％)和正常對(duì)照組(NC組)。 2、采集各組清晨靜脈血5ml，抗凝分離得到白

9、細(xì)胞作為研究對(duì)象。 3、采用RT-PCR檢測(cè)各組白細(xì)胞中VEGFR3mRNA的表達(dá)，并進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析。 4、記錄除NC組外的各組臨床資料，主要包括：空腹血糖、甘油三酯、膽固醇、收縮壓、舒張壓、糖化血紅蛋白、空腹C肽、餐后2hC肽等，并和VEGFR3mRNA表達(dá)進(jìn)行相關(guān)性分析。 5、采用細(xì)胞免疫熒光法檢測(cè)各組VEGFR3蛋白表達(dá)。 6、調(diào)整細(xì)胞濃度為2×106個(gè)/ml，采用細(xì)胞免疫熒光法檢測(cè)各組白細(xì)胞中VE

10、GFR3+細(xì)胞的數(shù)量，并進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析。 [結(jié)果]: 1、通過(guò)非參數(shù)檢驗(yàn)分析DF組、DM1組、DM2組和NC組患者VEGFR3mRNA的表達(dá)，實(shí)驗(yàn)組和NC組比較VEGFR3mRNA表達(dá)均減少，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.001)。 2、外周血白細(xì)胞VEGFR3mRNA表達(dá)和臨床指標(biāo)的相關(guān)性分析結(jié)果：VEGFR3mRNA表達(dá)的相關(guān)因素分別為空腹血糖(Spearman'sr=-0.518P<0.01)；收縮壓(Spea

11、rman's=-0.551P<0.01)；舒張壓(Spearman's=-0.391P<0.05)；糖化血紅蛋白(Spearman'sr=-0.633P<0.01)；與甘油三酯、膽固醇、空腹C肽，餐后2hC肽無(wú)顯著相關(guān)。 3、使用Mias-2000高清晰度計(jì)算機(jī)病理圖文報(bào)告系統(tǒng)檢測(cè)熒光強(qiáng)度，以每例標(biāo)本表達(dá)量最強(qiáng)的5個(gè)高倍視野(×400)的積分光密度值作為該例測(cè)定值。DM2組和DF組和NC組比較，VEGFR3蛋白表達(dá)減少，差異有統(tǒng)

12、計(jì)學(xué)意義(P<0.001)。 4、細(xì)胞免疫熒光化學(xué)結(jié)果比較顯示：DF組外周血白細(xì)胞中VEGFR3+細(xì)胞數(shù)量最少，其次為DM2組和DM1組，與NC組比較數(shù)量減少，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.001)。 [結(jié)論]: 1、糖尿病患者較正常人外周血白細(xì)胞中VEGFR3表達(dá)減少，并且隨著糖化血紅蛋白的升高，減少更為顯著。當(dāng)合并足部非缺血性潰瘍時(shí)，無(wú)論患者糖化血紅蛋白的高低，VEGFR3表達(dá)顯著減少。 2、糖尿病患者和

13、糖尿病足部非缺血性潰瘍患者外周血中VEGFR3mRNA表達(dá)減少和空腹血糖、糖化血紅蛋白、收縮壓以及舒張壓呈顯著負(fù)相關(guān)。 3、糖尿病足部非缺血性潰瘍患者外周血白細(xì)胞中VEGFR3+細(xì)胞(淋巴管內(nèi)皮祖細(xì)胞)數(shù)量減少，其可能為創(chuàng)面淋巴管內(nèi)皮形成減少的原因之一。 第三部分:葡萄糖和/或AGE對(duì)U937細(xì)胞VEGFC基礎(chǔ)分泌量和吞噬功能影響的研究 [目的]:探討U937細(xì)胞在葡萄糖、AGE以及兩者聯(lián)合刺激下VEGFC基礎(chǔ)分

14、泌量、吞噬功能的改變。 [方法]: 1、通過(guò)ELISA法檢測(cè)不同濃度、不同刺激時(shí)間的葡萄糖、AGE條件下U937細(xì)胞VEGFC基礎(chǔ)分泌量的改變，確定最適合的葡萄糖、AGE刺激時(shí)間和濃度，確定聯(lián)合刺激組的組成。 2、將相同培養(yǎng)環(huán)境中的U937細(xì)胞分為正常對(duì)照組(normalcontrol，NC)、葡萄糖刺激組(glucosegroup，GG)、AGE刺激組(AGEsgroup，AG)以及聯(lián)合刺激組(glucosea

15、ndAGEsgroup，GAG)。 3、采用臺(tái)盼藍(lán)染色法檢測(cè)各組培養(yǎng)后的細(xì)胞存活數(shù)量。 4、采用RT-PCR法檢測(cè)各組VEGFCmRNA的表達(dá)。 5、采用細(xì)胞免疫熒光法研究各組VEGFC蛋白的表達(dá)。 6、采用墨汁吞噬實(shí)驗(yàn)檢測(cè)各組U937細(xì)胞吞噬能力的改變。 [結(jié)果]: 1、經(jīng)過(guò)預(yù)實(shí)驗(yàn)確定1.5mmol/L葡萄糖刺激24h為葡萄糖刺激組，25ug/mlAGE刺激24h為AGE刺激組，兩者聯(lián)合

16、為聯(lián)合刺激組。 2、臺(tái)盼藍(lán)染色實(shí)驗(yàn)結(jié)果：各組有活性細(xì)胞數(shù)量比較，差異沒有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。 3、RT-PCR法檢測(cè)VEGFCmRNA，實(shí)驗(yàn)組和NC組比較VEGFCmRNA表達(dá)減少，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.001)。 4、定性分析VEGFC蛋白表達(dá)，未加熒光抗體的陰性對(duì)照組為(-)，NC組細(xì)胞內(nèi)熒光很明亮，定義為高度陽(yáng)性(+++)，AG組熒光強(qiáng)度較陰性對(duì)照組強(qiáng)，較NC組弱，為(++)，GG組細(xì)胞熒光強(qiáng)度

17、較弱，和陰性對(duì)照組以及NC組比較，熒光強(qiáng)度為(+)，GAG組呈不均勻的熒光，輪廓不清，熒光強(qiáng)度與陰性對(duì)照組基本相同為(-)。 5、墨汁吞噬實(shí)驗(yàn)結(jié)果：實(shí)驗(yàn)組和NC組比較吞噬功能降低，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.001)。 [結(jié)論]: 1、15mmol/L葡萄糖刺激24h、25ug/mlAGE刺激24h以及兩者聯(lián)合刺激對(duì)于U937細(xì)胞的存活沒有影響。 2、15mmol/L葡萄糖、25ug/mlAGE、以及兩者聯(lián)