血管緊張素Ⅱ受體1型自身抗體激活p38MAPK通路促進(jìn)內(nèi)皮微粒形成.pdf

1、本文主要從以下幾個方面展開論述:
　　第一部分 原發(fā)性高血壓患者血清緊張素Ⅱ受體1型自身抗體（AT1-AA）與循環(huán)內(nèi)皮微粒（EMP）相關(guān)性研究
　　目的：近年，有研究表明在原發(fā)性高血壓患者血清中常有血管緊張素II受體1型自身抗體（AT1-AA）存在，同時也有研究表明原發(fā)性高血壓患者血清中內(nèi)皮微粒（EMP）水平明顯高于正常人群，而血管緊張素Ⅱ受體1型自身抗體（AT1-AA）與內(nèi)皮微粒（EMP）的關(guān)系尚未闡明。
　　方法：

2、本研究招募華中科技大學(xué)同濟(jì)醫(yī)學(xué)院附屬協(xié)和醫(yī)院心血管內(nèi)科住院的經(jīng)過納入和排除標(biāo)準(zhǔn)篩選后的126名原發(fā)性高血壓患者，并選擇30名健康志愿者作為對照，所有研究對象均簽署知情同意書，實(shí)驗(yàn)計(jì)劃也獲得華中科技大學(xué)同濟(jì)醫(yī)學(xué)院附屬協(xié)和醫(yī)院倫理委員會的批準(zhǔn)。采用ELISA法分別檢測兩組人群血清AT1-AA滴度，流式細(xì)胞術(shù)檢測外周血中EMP的水平。
　　結(jié)果：高血壓患者外周血中AT1-AA抗體陽性率21.4％(27/126)，明顯高于正常對照組3.3

3、％(1/30)（P<0.05）.而且，AT1-AA抗體陽性高血壓患者的AT1-AA平均滴度明顯高于正常對照組和AT1-AA抗體陰性高血壓患者(O D值,0.580±0.189 vs0.159±0.021及0.152±0.043, P<0.01)。AT1-AA抗體陽性高血壓患者EMP水平明顯高于正常對照組和AT1-AA抗體陰性高血壓患者(649.9±91.9 vs48.9±7.6及153.6±15.7,P<0.01)線性回歸分析高血壓患者

4、外周血中EMP水平與AT1-AA抗體滴度關(guān)系，發(fā)現(xiàn)兩者成正相關(guān)關(guān)系（r2=0.3661,P<0.01）。
　　結(jié)論：原發(fā)性高血壓患者外周血中EMP水平與AT1-AA抗體滴度成正相關(guān)關(guān)系。
　　第二部分 原發(fā)性高血壓患者血管緊張素Ⅱ受體1型自身抗體（AT1-AA）促進(jìn)人臍靜脈血管內(nèi)皮細(xì)胞（HUVEC）內(nèi)皮微粒生成
　　目的：有研究報道指出血管緊張素II能夠刺激內(nèi)皮細(xì)胞促進(jìn)其內(nèi)皮微粒的生成，而我們最近的臨床研究發(fā)現(xiàn)原發(fā)性高

5、血壓患者外周血內(nèi)皮微粒（EMP）水平與血清中AT1-AA抗體滴度成正相關(guān)，然而AT1-AA做為一種有血管緊張素Ⅱ類似血管緊張素Ⅱ受體1型激動效應(yīng)的自身抗體是否也能促進(jìn)內(nèi)皮細(xì)胞微粒生成以及其機(jī)制尚不明確。因此，本研究擬借助原發(fā)性高血壓患者血清AT1-AA抗體以及人臍靜脈血管內(nèi)皮細(xì)胞（HUVEC）進(jìn)行體外實(shí)驗(yàn)，對AT1-AA是否能夠促進(jìn)EMP生成進(jìn)行研究。
　　方法：將經(jīng)ELISA檢測為AT1-AA抗體陽性原發(fā)性高血壓患者血清，用G蛋

6、白瓊脂糖層析柱進(jìn)行純化分離出血清中的總IgG抗體，之后再應(yīng)用耦聯(lián)有血管緊張素Ⅱ受體1型胞外第二環(huán)氨基酸序列短肽的抗體親和層析柱進(jìn)行純化，分離出AT1-AA抗體和非特異性IgG抗體。培養(yǎng)原代HUVEC，并在第二代至四代時進(jìn)行體外實(shí)驗(yàn)。應(yīng)用流式細(xì)胞術(shù)檢測被AT1-AA抗體及其它試劑刺激后的人臍靜脈血管內(nèi)皮細(xì)胞上清中的內(nèi)皮微粒的水平。同時用western blot檢測AT1-AA抗體刺激后人臍靜脈血管內(nèi)皮細(xì)胞中MAPK三條信號通路的活化情況。

7、同時應(yīng)用ERK,P38,JNK三條信號通路磷酸化抑制劑和血管緊張素受體阻斷劑氯沙坦（ARB）分別進(jìn)行干預(yù)，檢測三條信號通路在內(nèi)皮微粒生成中的作用。
　　結(jié)果：成功從AT1-AA抗體陽性原發(fā)性高血壓患者血清中純化分離出AT1-AA抗體。與對照非特異性IgG相比，AT1-AA抗體能夠明顯促進(jìn)HUVEC內(nèi)皮微粒的生成，其促進(jìn)作用呈時間和劑量依賴關(guān)系。而且，AT1-AA抗體刺激HUVEC后P38（P=0.0018）和ERK（P=0.000

8、4）磷酸化程度相對與對照組明顯增強(qiáng)，但是 JNK磷酸化程度僅輕度增強(qiáng)與對照組相比沒有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。P38磷酸化抑制劑（P=0.0046）及氯沙坦（P=0.0025）能夠明顯抑制AT1-AA抗體促進(jìn)內(nèi)皮微粒生成作用。
　　結(jié)論：AT1-AA可以通過激活P38MAPK信號通路促進(jìn)HUVEC內(nèi)皮微粒的生成,這種效應(yīng)可以有效被P38抑制劑或洛沙坦抑制。
　　第三部分 iEMP的功能研究
　　目的：內(nèi)皮微粒是細(xì)胞在活化，損傷或凋亡

9、時從細(xì)胞表面脫落的微小膜性囊泡，其表面攜帶有許多內(nèi)皮細(xì)胞膜受體及特異性抗原，其內(nèi)部也包裹有多種細(xì)胞蛋白及核苷酸。有研究報道指出在不同疾病狀態(tài)和刺激因素下產(chǎn)生內(nèi)皮微粒其功能并不完全相同如促凝，促炎以及加重內(nèi)皮功能障礙等，而AT1-AA抗體刺激HUVEC細(xì)胞生成的損傷性內(nèi)皮微粒(injury EMP，iEMP)功能尚無研究報道。
　　方法：應(yīng)用流式細(xì)胞術(shù)分選被AT1-AA或者非特異性IgG刺激24小時后HUVEC細(xì)胞上清中的iEMP和

10、對照EMP。然后，用1x105 microparticles/ml濃度的iEMP和EMP（這內(nèi)皮微粒濃度與高血壓患者平均內(nèi)皮微粒濃度水平相近）分別與HUVEC細(xì)胞共同培養(yǎng)24小時后，再與DCF-DA(10μmol/L)或者DAF-2 DA(10μmol/L)孵育一小時后，通過流式細(xì)胞術(shù)和激光共聚焦顯微鏡檢測HUVEC細(xì)胞中ROS活性氧自由基和一氧化氮NO的變化情況。用相同濃度的iEMP和EMP與原代大鼠心肌細(xì)胞進(jìn)行1小時的共孵育，觀察心

11、肌搏動次數(shù)，然后分別應(yīng)用AT1-AA和血管緊張素Ⅱ刺激心肌細(xì)胞后，再次觀察每分鐘心肌搏動次數(shù)的變化情況。
　　結(jié)果：與對照 EMP相比，iEMP明顯促進(jìn)HUVEC內(nèi)皮細(xì)胞的ROS水平升高（P=0.0127）。同時iEMP也明顯降低了HUVEC內(nèi)皮細(xì)胞NO水平（P=0.0251）與對照EMP相比。同時iEMP促進(jìn)ROS水平升高和N O水平降低作用呈時間和劑量依賴關(guān)系。與空白對照相比，iEMP和正常EMP對大鼠每分鐘心肌搏動無明顯影響