麻黃—石膏藥對配伍的化學成分、藥效及代謝組學研究.pdf

1、藥對又稱“對藥”、“對子藥”、“姐妹藥”，由兩味藥成對，個別由三味以上藥組成，是臨床上常用的相對固定的配伍形式。藥對的配伍是中藥復方配伍的最簡單、最基本和最常見的形式，其以一定證候特點及采用相應治法為前提，根據(jù)藥物的性味歸經(jīng)、升降浮沉，選擇性地將兩味中藥進行配對，其配伍蘊涵著豐富的客觀規(guī)律。
　　 本課題為麻黃類藥對組成規(guī)律的基礎(chǔ)研究（國家自然基金重點項目）的部分研究內(nèi)容。麻黃-石膏藥對是中醫(yī)臨床常用的藥對之一，在很多經(jīng)典方劑中

2、都有運用，例如麻杏石甘湯、越婢湯等，現(xiàn)代常用于感冒、支氣管肺炎、支氣管哮喘等屬表邪未盡，熱邪壅肺等證。本課題選擇經(jīng)方麻杏石甘湯及其“主藥對”麻黃-石膏藥對為研究對象，以2味藥的配比量為切入點，將麻黃-石膏藥對的配伍研究分解為1）藥對配伍前后的體外化學成分變化研究;2）主要藥理效應（毒性）比較研究;3）藥對配伍對對代謝組生物信息的干預研究;4）綜合分析麻黃-石膏藥對配伍、化學成分變化與藥理效應改變?nèi)唛g的相互關(guān)系。
　　 研究目的

3、：
　　 本研究以經(jīng)典的寒熱配伍藥對麻黃-石膏為研究對象，運用現(xiàn)代技術(shù)手段，從化學成分變化、量效關(guān)系、藥理效應改變、體內(nèi)代謝途徑與機制等方面對麻黃-石膏藥對進行較為全面和系統(tǒng)的研究，通過分析麻黃-石膏藥對不同比例配伍中指標性成分的含量、藥效作用及代謝組學等方面的差異，可以尋求其發(fā)揮作用的最佳配伍比例，找出其量效、時效以及毒效間的關(guān)系，從而有利于更好地發(fā)揮藥物的療效，并可進一步驗證、深化麻黃-石膏藥對“相使”的配伍關(guān)系，據(jù)此為麻黃

4、-石膏藥對配伍的制劑研究及其臨床應用，提供工作基礎(chǔ)和實驗依據(jù)。
　　 研究方法：
　　 《傷寒論》中麻杏石甘湯組成為:“麻黃四兩（去節(jié)）;杏仁五十個，去皮尖;甘草二兩，炙;石膏半斤。本實驗選取麻杏石甘湯中的藥對麻黃—石膏(1∶2)為研究對象，依據(jù)藥對文獻報道的配比上下成倍浮動，設(shè)計成三個配比1∶1、1∶2、1∶4三個配伍組。
　　 1.麻黃-石膏藥對不同配伍配比的體外化學成分研究
　　 建立測定麻黃-石膏

5、水煎液中麻黃類生物堿的HPLC方法并進行了精密度、穩(wěn)定性、加樣回收率等方法學考察;采用HPLC測定麻黃、麻黃石膏藥對1∶1、1∶2、1∶4三個配伍配比水煎液中麻黃類生物堿（去甲基麻黃堿、去甲基偽麻黃堿、麻黃堿、偽麻黃堿和偽麻黃堿）的含量并比較麻黃-石膏不同比例配伍前后水煎液中5種生物堿含量的變化。
　　 利用鈣離子試劑盒測定各組水煎液中的鈣離子并比較了麻黃-石膏不同比例配伍對Ca2+溶出的影響。
　　 采用反相高效液相色

6、譜法，選用Cosmosil C18柱(250mm×4.6mm，5μm)，流動相為乙腈-0.1％磷酸水溶液（含0.1％三乙胺）進行梯度洗脫，分析并確定了麻黃-石膏不同比例配伍水煎液的“共有峰”，并研究了不同比例配伍對“共有峰”的影響。
　　 2.麻黃石膏藥對不同比例配伍的主要藥理效應研究
　　 急性毒性研究昆明小鼠，雌雄各半，分為麻黃、麻黃-石膏(1∶1)、麻黃-石膏(1∶2)、麻黃-石膏(1∶4)5個給藥組，每組分別設(shè)5

7、個劑量組(n=10)，根據(jù)預實驗確定的Dn、Dm，定出相鄰兩組劑量比，組間比值為1∶0.8。實驗時將依據(jù)“低比稀釋法”配制不同濃度的藥液灌胃給予相應的小鼠。灌胃前禁食不禁水12小時，灌胃后觀察飼養(yǎng)7d，觀察小鼠的精神、活動、飲食、大小便、死亡等情況。記錄各組動物中毒癥狀及死亡情況。記錄實驗結(jié)果，并用Bliss軟件計算LD50值和95％置信區(qū)間。
　　 解熱作用研究采用干酵母混懸液誘導雄性SD大鼠發(fā)熱模型，選取體溫合格大鼠，隨機分

8、為隨機分為19組，即空白對照組、模型對照組、阿司匹林組、麻黃高中低劑量組、石膏高中低組、麻杏石甘湯組、麻黃石膏(1∶1)高中低低劑量組、麻黃石膏(1∶2)高中低劑量組、麻黃石膏(1∶4)高中低組，每組6只，灌胃給藥（正常對照組和模型對照組均給予等容積蒸餾水），給藥后每小時測量肛溫一次，連續(xù)測量三次。計算各給藥組8h對大鼠體溫升高抑制率(％)。利用Calcusyn統(tǒng)計軟件(Biosoft，USA)分析麻黃-石膏兩者的相互作用。
　　

9、 平喘作用研究采用卵蛋白誘導的哮喘大鼠模型，將60只SD大鼠隨機分為正常對照組、模型組、地塞米松組、麻石1∶2（高、中、低）劑量組、麻黃-石膏(1∶1)組和麻黃-石膏（1∶4，單味麻黃組、石膏組共10組，每組6只。觀察麻黃、石膏配伍前后對大鼠引喘潛伏期、肺干濕重、EOS、WBC計數(shù)影響。
　　 3.麻黃石膏藥對不同配伍干預干酵母誘導熱病癥候的代謝組學研究
　　 “發(fā)熱”大鼠模型的建立及其代謝組學研究將12只雄性Wist

10、ar大鼠隨機分為2組(n=6)，空白對照組和模型組（背部皮下注射20％酵母混懸液10mL·kg-造模），將大鼠（正常對照組，模型組）置于代謝籠中收集6h尿液，尿液直接衍生化。采用G C-MS聯(lián)用技術(shù)測定各組大鼠尿液代謝物譜。運用XCMS工具箱對代謝物譜進行峰識別、峰對齊和去噪等處理，得到由保留時間、樣品號及信號強度組成的三維矩陣，將矩陣導入模式識別軟件Simca-P12.0(瑞典，Umetrics AB，Umea)進行主成分分析(PCA

11、)、偏最小二乘法判別分析(PLS-DA)。PLS-DA的結(jié)果中列出各變量的變量重要性值VIP(Variable Importance in the Projection)，根據(jù)VIP大小排列，其中VIP值大于1的變量被認為是變化明顯且對區(qū)分貢獻較大，作為標記物分析，通過與氣質(zhì)工作站的數(shù)據(jù)庫、對照品及查詢網(wǎng)站進行對比分析，選擇匹配度較高的內(nèi)源性生物標志物作為鑒定結(jié)果。
　　 麻黃-石膏對“發(fā)熱”大鼠的代謝組學研究將雄性Wistar

12、大鼠隨機分為5組，即空白對照組、模型組、麻黃組、麻黃石膏1∶2組和石膏組，每組6只。除空白組外，大鼠背部皮下注射20％干酵母（10mL/kg大鼠體重）造模，各給藥組分別在造模后6 h灌胃給藥一次，收集給藥后6 h尿液，對空白組、模型組、麻黃組、麻黃石膏1∶2組和石膏組的尿液代謝輪廓進行主成分分析(PCA)和PLS-DA分析，對其特征抽提及模式識別。選擇VIP值大于1的物質(zhì)作為干酵母誘導發(fā)熱模型的潛在特異性生物標志物，通過與氣質(zhì)工作站的數(shù)

13、據(jù)庫、對照品及查詢網(wǎng)站進行對比分析，選擇匹配度較高的內(nèi)源性生物標志物作為鑒定結(jié)果。分析麻黃組、麻黃石膏1∶2組和石膏組生物標志物的差異及水平變化，結(jié)合現(xiàn)有的生物化學知識闡釋麻黃、石膏藥對配伍前后的調(diào)節(jié)機制。
　　 實驗結(jié)果：
　　 1.麻黃石膏藥對不同比例配伍的體外化學成分研究
　　 麻黃-石膏藥對不同比例配伍對麻黃類生物堿含量的影響水煎液中5種生物堿（去甲基偽麻黃堿、去甲基麻黃堿、麻黃堿、偽麻黃堿和偽麻黃堿）含

14、量的變化實驗結(jié)果顯示，除麻黃-石膏(1∶4)配伍組中的去甲基麻黃堿含量比單味麻黃組降低(P＜0.05)，麻黃-石膏(1∶1)和麻黃-石膏(1∶2)配伍組各生物堿含量差異無統(tǒng)計學意義。麻黃-石膏(1∶1)、麻黃-石膏(1∶2)、麻黃-石膏(1∶4)三個配伍組的水煎液中，麻黃-石膏(1∶2)的總生物堿含量最高。
　　 麻黃-石膏藥對不同比例配伍對鈣離子含量的影響利用析因分析麻黃、石膏不同比例配伍對Ca2+溶出量的影響∶麻黃-石膏(1

15、∶1)組之間交互作用顯著(F=22.222，P=0.002)，通過比較發(fā)現(xiàn)，配伍后Ca2+溶出量則低于麻黃和石膏單煎所得Ca2+總量的加和，二者的差異具有顯著性意義，說明麻黃-石膏(1∶1)配伍組會抑制Ca2+的溶出?？梢哉J為麻黃-石膏(1∶1)二者之間有拮抗作用。麻黃-石膏(1∶2)組之間交互作用顯著(F=21.144，P=0.002)，通過含量比較發(fā)現(xiàn)，配伍后Ca2+溶出量則低于麻黃和石膏單煎所得Ca2+總量的加和，二者的差異具有顯

16、著性意義，說明麻黃-石膏(1∶2)配伍組會抑制Ca2+的溶出。麻黃-石膏(1∶4)組之間交互作用顯著(F=95.617，P=0.000)，通過含量比較發(fā)現(xiàn)，配伍后Ca2+溶出量則低于麻黃和石膏單煎所得Ca2+總量的加和，二者的差異具有顯著性意義，說明麻黃-石膏(1∶4)配伍組會抑制Ca2+的溶出。
　　 麻黃-石膏不同比例配伍對水煎液“共有峰”的影響不同比例麻黃-石膏的合煎液，其化學成分變化較為復雜，配伍比例不同，10個共有峰的

17、情況變化也不相同。有的峰峰面積增大，有的降低，有的峰面積基本不保持不變。
　　 2.麻黃石膏藥對不同比例配伍的主要藥理效應研究
　　 急性毒性實驗結(jié)果各比例配伍組中，在能夠引起試驗動物一半死亡的藥物劑量下，麻黃所占的比例及其可信區(qū)間分別為單味麻黃131.67(108.23～166.81)g·kg-1，麻黃石膏(1∶1)113.22(96.32～153.82) g·kg-1，麻黃石膏(1∶2)124.15(107.48～1

18、47.38) g·kg-1，麻黃石膏(1∶4)106.05(89.14～134.02) g·kg-1。由表可知，麻黃的LD50值從大到小的順序依次:麻黃≌麻黃石膏(1∶2)＞麻黃石膏(1∶1)＞麻黃石膏(1∶4)。
　　 解熱實驗結(jié)果與模型組相比，麻黃組、麻黃石膏(1∶1)組、麻黃石膏(1∶2)組、麻黃石膏(1∶4)組均具有解熱作用，且呈一定的量-效關(guān)系。各給藥組8h抑制率(％)從大到小排列為:麻石1∶2高劑量組(62.7)、麻

19、杏石甘湯全方組(59.7)、麻黃高劑量組(59.0)、麻石1∶2中劑量組(53.6)、麻黃中劑量組(49.4)、麻石1∶1高劑量組(47.7)、麻石1∶4高劑量組(47.2)、麻石1∶1中劑量組(43.1)、麻石1∶4中劑量組(37.1)、石膏高劑量(33.0)、麻石1∶1低劑量組(30.8)、麻石1∶4低劑量組(28.4)、麻石1∶2低劑量組(21.7)、麻黃低劑量組(21.6)、石膏中劑量(10.9)、石膏低劑量(4.6)。通過比較

20、麻黃石膏藥對3個配比解熱的作用時間與作用強度，我們發(fā)現(xiàn)麻黃石膏(1∶2)的解熱作用最佳，解熱持續(xù)時間最長。麻黃-石膏(1∶2)在解熱方面具有協(xié)同增效作用。
　　 平喘作用結(jié)果麻石1∶2高、中劑量組均能延長引喘潛伏期(P＜0.01)，麻石1∶2配伍組作用效果優(yōu)于麻石1∶1、麻石1∶2組、單味麻黃、單味石膏組;麻石1∶2高、中劑量組、單味麻黃組均能減少EOS數(shù)量(p＜0.01);麻石1∶2高劑量組和麻石1∶4組組均能減少WBC數(shù)量(

21、p＜0.01);麻石1∶2組高、中、低劑量、麻黃組、石膏組和麻石1∶4組均能降低肺干濕重比值(p＜0.01);通過引喘潛伏期、肺干濕重比值、EOS和WBC計數(shù)綜合分析比較，我們發(fā)現(xiàn)麻黃石膏(1∶2)的平喘作用最佳，麻黃-石膏(1∶2)其合用的效果優(yōu)于同等劑量下的單味麻黃或石膏。
　　 3.麻黃石膏藥對不同比例配伍干預“發(fā)熱”大鼠尿液代謝組學研究
　　 “發(fā)熱”大鼠模型的建立及其代謝組學研究通過對模型組和空白組大鼠尿液代謝

22、物組進行PCA分析，兩組大鼠的尿液樣本可以在PCA的得分圖上較為明顯的區(qū)分開來，提示干酵母誘導的“發(fā)熱”模型成功，大鼠機體代謝網(wǎng)絡(luò)發(fā)生了明顯的變化。為進一步關(guān)注干酵母引起的尿液代謝差異，找到與干酵母誘導發(fā)熱相關(guān)的代謝通道的變化，實驗采用PLS-DA法對模型組大鼠和正常組大鼠樣本重新建模，用以鑒別造成上述分離的差異變量。結(jié)果顯示，模型組和正常組在PC1上明顯分離，并且該模型有較高的解釋率和預測率(R2Xcum=0.878，R2Ycum=0

23、.993，Q2Ycum=0.969)。通過上述PLS-DA法對兩組大鼠樣本重新建模后，根據(jù)S-Plot圖(圖4-6A)中離子的置信度和VIP值可知離子對分類貢獻的大小，找到VIP值大于1的與干酵母誘導發(fā)熱高度相關(guān)的代謝物(圖4-6B)，運用氣質(zhì)工作站的數(shù)據(jù)庫（WILEY275.L及NIST05.L），結(jié)合自建的對照品物質(zhì)庫及查詢網(wǎng)站(http://www.hmdb.ca/和http://metlin.scripps.edu/metabo

24、 searchalt2.php)查找差異變量。分析結(jié)果顯示，模型組和對照組共有10個物質(zhì)有顯著性差異，分別是:檸檬酸、酮戊二酸、3-丙酸、苯乙酸、甘氨酸、正丁胺、碳酸、丙氨酸、苯丙酮酸、苯甲酸。
　　 麻黃、石膏及其合煎液對“發(fā)熱”大鼠的代謝組學研究結(jié)果通過對空白組、模型組、麻黃組、麻黃桂枝組、石膏組大鼠尿液代謝物組進行PCA分析，5組大鼠的尿液樣本可以在PCA的得分圖上較為明顯的區(qū)分開來，說明來大鼠給予不同處理后，其代謝物譜差

25、異明顯。不同處理組的樣品之間的細微差異可以通過PLS-DA進行分析研究。
　　 麻黃組和模型組相比，麻黃組中丙二酸、苯甲酸、丁二酸、丙氨酸、甘氨酸、纈氨酸、脯檬酸、辛二酸、尿素、馬尿酸、苯丙酸、苯丙氨酸、2-羥基喹啉-羧酸含量升高(P＜0.05)。
　　 石膏處理組和模型組相比，石膏中苯甲酸、丁二酸、丙氨酸、3-丙酸、脯氨酸、辛二酸、L-谷氨酸含量升高(P＜0.05)。
　　 麻黃-石膏組與模型組相比，麻黃-石膏

26、組中丙二酸、苯甲酸、丁二酸、甘氨酸、3-丙酸、脯氨酸、辛二酸、尿素、馬尿酸、苯丙酸、苯丙氨酸、半胱氨酸含量升高（P＜0.05）。
　　 麻黃-石膏組與單味石膏相比，丙二酸、苯甲酸、甘氨酸、異亮氨酸、馬尿酸、苯丙酸、1-脯氨酸含量升高(P＜0.05)。
　　 石膏組與單味麻黃相比，麻黃組中丙二酸、苯甲酸、丁二酸、3-丙酸、琥珀酸、尿素、馬尿酸、苯丙酸、1-脯氨酸含量升高(P＜0.05)。
　　 對以上這些代謝物含量

27、用單變量方差分析方法進行檢驗，其結(jié)果與PLS-DA的分析結(jié)果基本一致。
　　 結(jié)論:
　　 通過對麻黃-石膏“藥對”進行化學成分、藥效及代謝組學三方面的研究，確定麻黃與石膏配伍應用后，麻黃-石膏(1∶2)配伍比例組在解熱、平喘方面優(yōu)于麻黃-石膏(1∶1)、麻黃-石膏(1∶4)配伍組，該最優(yōu)比例與原方麻杏石甘湯中麻黃-石膏1∶2相一致，從化學成分的角度，發(fā)現(xiàn)其增效的物質(zhì)基礎(chǔ)與增加其有效成分的含量（總生物堿以及Ca2+的溶出