重組蛋白Ag85A-IL-17A構建及其抗哮喘小鼠氣道炎癥的實驗研究生.pdf

1、研究背景:哮喘是一種以Th2型免疫反應亢進為特點的氣道慢性炎癥。IL-4、IL-13抗體在小鼠哮喘模型中發(fā)揮了一定程度的治療或者預防作用。近來研究發(fā)現(xiàn)IL-17A在哮喘的發(fā)生、發(fā)展中起到重要作用，尤其是以中性粒細胞浸潤為特點的重癥哮喘。因此，我們推斷IL-17A抗體可能對重癥哮喘的治療或者預防起到一定作用。機體對于自身抗原機體通過一系列的免疫耐受過程避免自身免疫反應，細胞因子自身不會在體內(nèi)誘導自身抗體的生成。Boissier推測如果自身

2、蛋白結合外源性蛋白，可以通過外源型蛋白的T細胞表位誘導B細胞反應，產(chǎn)生自身蛋白相關的中和抗體。Ag85A是卡介苗(BCG)中免疫原性較強的蛋白復合體Ag85中的三個主要的蛋白之一，能夠刺激Th1型免疫反應，提高IFN-γ和IL-12含量。
　　目的:構建、表達重組蛋白Ag85A-IL-17A，研究其在哮喘小鼠氣道炎癥損傷中的作用。共分四步:(1)重組蛋白Ag85A-IL-17A的原核表達、純化;(2)重組蛋白Ag85A-IL-17

3、A的B細胞表位預測;(3)重組蛋白Ag85A-IL-17A的免疫原性和抗原性檢測;(4)重組蛋白Ag85A-IL-17A在哮喘小鼠氣道炎癥損傷中的作用。
　　方法:(1)利用分子克隆的方法，將IL-17a的基因片段克隆至pET28a-Ag85a，獲得pET28a-Ag85a-IL-17a的原核表達載體，將載體轉化至大腸桿菌BL21(DE3)中，經(jīng)IPTG誘導獲得重組蛋白Ag85A-IL-17A。SDS-PAGE電泳和Western

4、-blot鑒定正確的重組蛋白經(jīng)Ni-NTA親和層析及透析復性后即可獲得純化的Ag85A-IL-17A。(2)通過生物信息學的方法，使用Bcepred軟件預測重組蛋白Ag85A-IL-17A的B細胞表位，并與IL-17A的B細胞表位做對比。(3)利用免疫學的方法，分析重組蛋白Ag85A-IL-17A的抗原性和免疫原性。實驗小鼠分三組，PBS組、Ag85A組、Ag85A-IL-17A組，分別檢測免疫蛋白后小鼠血清的IL-17A特異性抗體的滴

5、度。(4)構建哮喘小鼠的動物模型，免疫重組蛋白Ag85A-IL-17A，研究其對哮喘小鼠氣道炎癥的作用。實驗小鼠分四組，分別為PBS組、OVA組、OVB組以及Ag85A-IL-17A組。瑞吉氏染色觀察各組BALF中炎癥細胞數(shù)量及分類，ELISA測定BALF中Th2/Th17細胞因子含量，HE染色進行肺組織病理切片炎癥評分，流式細胞術檢測體外培養(yǎng)的脾細胞IL-13+T細胞含量以及RT-PCR檢測肺組織趨化因子CXCL1、CCL2及轉錄因子

6、RORγt的表達水平。
　　結果:克隆獲得編碼序列經(jīng)測序鑒定與GenBank中的數(shù)據(jù)一致，成功構建了重組質(zhì)粒pET28a-Ag85a-IL-17a，經(jīng)SDS-PAGE電泳和Western-blot鑒定蛋白Ag85A-IL-17A在E.coli中成功表達。重組蛋白DNA序列包含1287個堿基，蛋白含429個氨基酸，蛋白的分子量在50kDA左右。重組蛋白Ag85A-IL-17A保留了IL-17A的3個的B細胞表位，分別是LGAKVSS

7、RRPSDYLNRST176-193，TLHRNEDP197-204，和LVLKREP242-248。重組蛋白Ag85A-IL-17A具有抗原性，能夠與IL-17A抗體結合，并且具有免疫原性，能夠誘導小鼠體內(nèi)產(chǎn)生較高濃度的IL-17A特異性抗體。OVB組哮喘小鼠模型BALF中IL-17A、IL-6明顯高于普通哮喘小鼠模型，其炎癥細胞分類中性粒細胞明顯高于OVA組哮喘小鼠模型。重組蛋白Ag85A-IL-17A顯著降低了BALF中Th17型

8、細胞因子IL-17A、IL-6的含量以及Th2型細胞因子IL-13、IL-4的水平。重組蛋白Ag85A-IL-17A明顯降低免疫小鼠小氣道周圍炎癥以及BALF中總細胞數(shù)、嗜酸性粒細胞及中性粒細胞的數(shù)量。重組蛋白Ag85A-IL-17A免疫小鼠的體外培養(yǎng)的脾細胞IL-13+T細胞的數(shù)量較OVB哮喘組明顯降低，肺組織CXCL1和CCL2mRNA的水平也明顯降低，而轉錄因子ROR-γt的表達水平?jīng)]有明顯改變。
　　結論:(1)成功構建、