廣東和廣西部分地區(qū)蝙蝠攜帶登革病毒及流行性乙型腦炎病毒的調(diào)查研究.pdf

1、研究背景和目的 登革熱(Denguefever,DF)和流行性乙型腦炎(Japaneseencephalitis，JE，也稱為日本腦炎，簡(jiǎn)稱乙腦)是重要的蟲媒病毒傳染病，其病原體分別為登革病毒(Denguevirus，DV)和乙腦病毒(Japaneseencephalitisvirus，JEV)。近年來在東南亞、印度、西太平洋和南美洲大部分地區(qū)經(jīng)常爆發(fā)登革熱。爆發(fā)規(guī)模越來越大，情況越來越嚴(yán)重，其中登革出血熱(Denguehemo

2、rrhagicfever，DHF)的比例也越來越大。乙腦在亞洲每年有3,000～5,000份臨床病例報(bào)道，其流行范圍也有不斷擴(kuò)大趨勢(shì)，東起西太平洋島嶼，西到巴基斯坦邊界，北起朝鮮，南到巴布亞新幾內(nèi)亞都已經(jīng)成為乙腦的流行區(qū)。 我國(guó)DF和DHF的流行也有相當(dāng)長(zhǎng)的歷史，甚至可以追溯到1873年。20世紀(jì)50年代以前我國(guó)沿海大部分地區(qū)均發(fā)生過DF，此后30多年未發(fā)生流行，直至1978年廣東佛山再次發(fā)生登革4型流行，隨后在沿海省份廣東、廣

3、西和海南等省間斷的流行至今。我國(guó)乙腦分布在除新疆、青海、西藏和東北北部外的所有省(自治區(qū))。20世紀(jì)50～70年代乙腦呈現(xiàn)周期性流行，病例主要分布在東部沿海地區(qū)，70年代后，由于大規(guī)模使用乙腦疫苗，乙腦發(fā)病率明顯下降，基本上控制了全國(guó)范圍的流行。近年來，乙腦報(bào)告發(fā)病率基本控制在1/10萬(wàn)以下；但目前每年仍發(fā)生8,000～12,000左右乙腦病例，局部地區(qū)爆發(fā)或流行時(shí)有發(fā)生。 登革熱的主要傳播媒介是埃及伊蚊和白紋伊蚊，一般認(rèn)為，登

4、革病毒主要感染人和低等靈長(zhǎng)類動(dòng)物。在城市型登革病毒感染循環(huán)中，病人和隱性感染者是主要傳染源。在叢林型疫源地中，猴類動(dòng)物是主要傳染源。但是，也有人認(rèn)為登革病毒的宿主尚未明確，而且登革熱的發(fā)病有來無(wú)影去無(wú)蹤的特點(diǎn)，除了人類和猴、猩猩、狒狒在內(nèi)的低等靈長(zhǎng)類動(dòng)物外，有人報(bào)道從蝙蝠也分離到登革病毒。 蚊蟲也是乙腦病毒的主要傳播媒介，已報(bào)道從30多種不同的蚊蟲體內(nèi)分離出乙腦病毒，其中三帶喙庫(kù)蚊是最重要的傳播蚊媒。一般認(rèn)為，乙腦病毒存在于庫(kù)蚊

5、和野生水鳥之間的感染循環(huán)中，豬是重要的擴(kuò)增宿主。但是一般來說蟲媒病毒都有不只一種宿主，乙腦病毒還可以感染綿羊、家養(yǎng)的燕、猴子、金黃地鼠、小白鼠并可致病，還有報(bào)道從蝙蝠分離出乙腦病毒，表明其儲(chǔ)存宿主范圍廣。 由于對(duì)登革熱和乙腦的自然宿主范圍尚未完全清楚，所以仍有必要進(jìn)行深入的調(diào)查研究。全面掌握這兩種疾病的流行病學(xué)特點(diǎn)，對(duì)于其預(yù)防和控制具有重要的意義。 蝙蝠是一個(gè)天然的病毒儲(chǔ)存庫(kù)，可以攜帶多種醫(yī)學(xué)病毒，特別是近年發(fā)生的一些新

6、發(fā)傳染病被認(rèn)為與蝙蝠有關(guān)。蝙蝠能否作為登革病毒和乙腦病毒的儲(chǔ)存宿主?本研究擬通過調(diào)查廣東和廣西兩個(gè)省(自治區(qū))部分地區(qū)的蝙蝠是否攜帶登革病毒和乙腦病毒，了解蝙蝠作為登革病毒和乙腦病毒自然貯存宿主的可能性。 研究方法 1.標(biāo)本處理2004年9月至2005年11月期間7次收集廣東及廣西部分地區(qū)的蝙蝠。收集的蝙蝠鑒定種類后解剖取腦組織標(biāo)本和血清標(biāo)本，腦組織標(biāo)本加Hanks緩沖溶液用高壓消毒過的微量研磨器無(wú)菌研磨，研磨液離心后取

7、部分上清和血清標(biāo)本分別進(jìn)行RT-PCR和細(xì)胞培養(yǎng)分離方法檢測(cè)，剩余標(biāo)本放置-70℃保存。 2.細(xì)胞培養(yǎng)將腦組織研磨液上清和血清標(biāo)本分別用含有每ml含有100單位青霉素和硫酸鏈霉素的Hanks緩沖溶液1∶10稀釋，將已培養(yǎng)好長(zhǎng)成單層的Vero細(xì)胞和C6/36細(xì)胞棄去原培養(yǎng)基，加入稀釋好的接種液置于37℃、5％CO2恒溫細(xì)胞培養(yǎng)箱內(nèi)吸附2h，然后棄去吸附液，加入含2％小牛血清的RPMI-1640培養(yǎng)基(Vero細(xì)胞)和DMEM培養(yǎng)基

8、(C6/36細(xì)胞)繼續(xù)培養(yǎng)。觀察細(xì)胞變化，根據(jù)細(xì)胞形態(tài)變化判斷病毒分離陰性或者陽(yáng)性，若細(xì)胞形態(tài)有明顯變化判斷為陽(yáng)性，如細(xì)胞圓縮、顆粒增多、融合成片，最后碎裂死亡，做進(jìn)一步培養(yǎng)分離及分子生物學(xué)檢測(cè)；若沒有細(xì)胞形態(tài)變化做RT-PCR檢測(cè)是否有病毒增殖，連續(xù)盲傳三代，若仍未有形態(tài)變化且RT-PCR產(chǎn)物未擴(kuò)增出目的基因片斷就判斷為陰性。 3.RT-PCR分別以DV和JEV病毒的NS1蛋白基因區(qū)和C/prM蛋白基因區(qū)為靶序列設(shè)計(jì)了兩對(duì)通用

9、RT-PCR引物，可同時(shí)檢測(cè)出DV1～4型和JEV。先用Trizol核酸提取試劑提取腦組織研磨液和血清標(biāo)本中的核糖核酸(RNA)，測(cè)定RNA濃度確定RNA提取成功；用M-MLV逆轉(zhuǎn)錄酶體系和隨機(jī)引物進(jìn)行逆轉(zhuǎn)錄(RT)合成cDNA；采用通用引物，以逆轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物cDNA為模板進(jìn)行聚合酶鏈反應(yīng)(PCR)檢測(cè)所采集蝙蝠標(biāo)本中的登革病毒和乙腦病毒。 結(jié)果 從2004年9月到2005年11月收集了4個(gè)科9個(gè)種共905只蝙蝠，其中：犬蝠

10、395只、棕果蝠154只、普通長(zhǎng)翼蝠5只、小黃蝠52只、中菊頭蝠228只、中華菊頭蝠15只、小菊頭蝠41只、雙色蹄蝠8只、普氏蹄蝠7只。食果蝙蝠數(shù)量最多，占檢測(cè)總數(shù)的60.66％，犬蝠和棕果蝠分別占檢測(cè)總數(shù)的43.65％和17.02％；食蟲蝙蝠中以中菊頭蝠數(shù)量最多，占檢測(cè)總數(shù)的25.19％，其余6種蝙蝠共121只，只占檢測(cè)總數(shù)的13.37％，均為食蟲蝙蝠。蝙蝠的來源地分布于廣東的懷集縣、羅定市、廣州市、惠州市和廣西的貴港市、梧州市、藤縣

11、等7個(gè)縣市。棕果蝠的棲息地以廢棄和敗落的房屋為主，犬蝠和小黃蝠為樹棲性，普通長(zhǎng)翼蝠、小菊頭蝠、中華菊頭蝠、雙色蹄蝠和普氏蹄蝠均棲于洞穴。利用細(xì)胞培養(yǎng)分離方法和RT-PCR方法在905只蝙蝠標(biāo)本中均未分離、檢測(cè)到登革病毒和乙腦病毒。 結(jié)論 本研究未發(fā)現(xiàn)所調(diào)查的蝙蝠攜帶登革病毒和乙腦病毒，結(jié)果提示上述廣東和廣西部分地區(qū)蝙蝠攜帶登革病毒和乙腦病毒的量和攜帶率低。由于受所調(diào)查蝙蝠種類和數(shù)量不夠多、蝙蝠的代表性不強(qiáng)；采集蝙蝠的時(shí)機(jī)