微粒在COPD患者BALF中變化的研究.pdf

1、研究背景與目的:
　　微粒(microparticles, MPs)是一種微小的、富含磷脂的細(xì)胞膜碎片,由細(xì)胞凋亡或受到刺激后以出芽方式產(chǎn)生,其直徑為50nm-2μm,含有多種細(xì)胞表面受體以及mRNA等,具有多種生物學(xué)功能。在受到刺激或凋亡等情況下能夠產(chǎn)生相應(yīng)微粒的細(xì)胞稱之為“親代細(xì)胞”(Origin cells)。目前根據(jù)來源不同可將微粒分為巨噬細(xì)胞微粒(Macrophage-derived microparticles, MM

2、Ps)、T淋巴細(xì)胞微粒(T Lymphocyte-derived microparticles,TLMPs)、B淋巴細(xì)胞微粒(B Lymphocyte-derived microparticles, BLMPs)、血小板微粒(Platelet microparticles,PMPs)以及內(nèi)皮細(xì)胞微粒(Endothelial microparticles, EMPs)等。微粒被認(rèn)為反映了細(xì)胞增殖、受刺激或者凋亡的一個動態(tài)平衡,當(dāng)這種動態(tài)平

3、衡由于各種原因被打破后將導(dǎo)致血循環(huán)中微粒的大量生成,它們能夠攜帶生物活性分子至靶器官或至其他微粒,刺激產(chǎn)生細(xì)胞因子、生長因子、組織因子等,引發(fā)多種生物學(xué)效應(yīng),破壞機(jī)體內(nèi)環(huán)境的相對穩(wěn)定,并在很大程度上影響疾病的發(fā)生、發(fā)展和轉(zhuǎn)歸。新近研究表明,微粒具有促炎、促凝、調(diào)節(jié)免疫等作用,與炎癥、自身免疫性疾病、腫瘤、敗血癥、瘧疾、血液系統(tǒng)疾病等密切相關(guān)。
　　而作為人體內(nèi)唯一由兩套血液供應(yīng)的肺臟,微粒對它的影響可能是巨大的。我們的前期體外研究

4、發(fā)現(xiàn)淋巴細(xì)胞微粒(LMPs)能抑制人支氣管上皮細(xì)胞生長,使其生長周期阻滯在G1期,而這種生長周期阻滯作用與P21、P27表達(dá)上調(diào)有關(guān),并且可能是通過AKT/FOXO1信號通路來實現(xiàn)的;該結(jié)果提示,微粒可能與呼吸系統(tǒng)疾病也存在著密切關(guān)系,很有必要進(jìn)行深入研究。慢性阻塞性肺疾病(chronic obstructive pulmonary disease, COPD)是最常見的慢性氣道炎癥性疾病,其患病人數(shù)多、病死率高并嚴(yán)重影響患者的勞動能力

5、和生活質(zhì)量;現(xiàn)已證實巨噬細(xì)胞、淋巴細(xì)胞、內(nèi)皮細(xì)胞及血小板等在COPD疾病進(jìn)程中具有重要作用。目前上述細(xì)胞產(chǎn)生的微粒在COPD患者體內(nèi)的含量及變化尚未知,有關(guān)微粒在COPD中的相關(guān)研究可能會大大開闊該領(lǐng)域的研究視野。本研究擬檢測不同病期 COPD患者支氣管肺泡灌洗液(bronchoalveolar lavage fluid, BALF)中MMPs、TLMPs、BLMPs、PMPs以及EMPs的變化情況,初步探討各種微粒與COPD的可能關(guān)系

6、,以期為臨床工作中對COPD病情及預(yù)后的評估提供一個新的檢測指標(biāo)。
　　方法:
　　本試驗采集COPD患者以及對照者的BALF。利用流式細(xì)胞技術(shù)檢測灌洗液中的MMPs、TLMPs、BLMPs、EMPs、PMPs的絕對計數(shù)。
　　具體如下:
　　1.BALF的采集
　　1.1. BALF的收集:收集COPD不同分期的住院、門診患者及對照者的BALF,在行纖維支氣管鏡支氣管肺泡灌洗術(shù)前先予以阿托品0.5mg肌內(nèi)

7、注射,并采用2％利多卡因溶液對氣道實施局部麻醉。用20ml無菌生理鹽水(37℃,PH7.3)選擇支氣管的第三或者第四級亞段進(jìn)行灌洗。將灌洗液最大限度吸出(回收率約50%),注意在進(jìn)行支氣管肺泡灌洗操作過程中要動作輕柔,不能額外增加研究對象的痛苦。其中含有痰液、血液或者碳沫的標(biāo)本視為不合格。將符合標(biāo)準(zhǔn)的灌洗液置入冰盒迅速送往實驗室,進(jìn)行離心處理。
　　1.2. BALF預(yù)處理:將符合標(biāo)準(zhǔn)的灌洗液在4℃條件下2000×g離心10min

8、,每次離心后留取上清液,丟棄底部較渾濁液體,重復(fù)以上操作3次后,將處理好的上清液移入一次性微量離心(EP)管中(100μL/管)。
　　2.流式細(xì)胞技術(shù)檢測各組BALF中MMPs、TLMPs、BLMPs、PMPs、EMPs的計數(shù):
　　在避光條件下將AECOPD組、COPD穩(wěn)定期組、對照組BALF各分為6管(100μL/管),在第1管中加入CD14抗人抗體5μL標(biāo)記MMPs,第2管中加入CD4抗人抗體5μL標(biāo)記 CD4+TL

9、MPs,第3管中加入CD8抗人抗體5μL標(biāo)記 CD8+TLMPs,第4管中加入CD20抗人抗體20μL標(biāo)記BLMPs,第5管中加入E(5μL)+CD142(5μL)抗人抗體標(biāo)記PMPs,第6管中加入CD41(5μL)+CD142(5μL)抗人抗體標(biāo)記EMPs。震蕩混勻后,分別上機(jī)檢測。
　　結(jié)果:
　　1. BALF采集情況
　　符合入選條件用于研究TLMPs及MMPs變化情況的BALF包括AECOPD組患者35例,C

10、OPD穩(wěn)定期組患者12例,對照組31例。符合入選條件用于研究BLMPs變化情況的BALF包括AECOPD組患者33例,COPD穩(wěn)定期組患者12例,對照組31例。符合入選條件用于研究PMPs及EMPs的BALF包括AECOPD組患者35例,COPD穩(wěn)定期組患者12例,對照組20例。
　　2. COPD患者各種微粒數(shù)目變化情況
　　2.1. MMPs數(shù)目變化情況:與對照組[45(1-2296)]相比, AECOPD組[906(2

11、5-15537)]和COPD穩(wěn)定期組[737(33-10149)]MMPs數(shù)目顯著增高(P<0.05),但AECOPD組MMPs數(shù)目與COPD穩(wěn)定期組相比無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05)。多組間比較,MMPs數(shù)目具有顯著差異(P<0.05)。
　　2.2. CD8+TLMPs數(shù)目變化情況:AECOPD組CD8+TLMPs數(shù)目[3683(100-35159)]顯著高于COPD穩(wěn)定期組[1020.5(46-3297)]和對照組[29(3-

12、1012)](P<0.05),COPD穩(wěn)定期組CD8+ TLMPs數(shù)目顯著高于對照組(P<0.05)。多組間比較,CD8+ TLMPs數(shù)目具有顯著差異(P<0.05)。
　　2.3. CD4+TLMPs數(shù)目變化情況:CD4+TLMPs數(shù)目在AECOPD組[494(5-15585)]、COPD穩(wěn)定期組[953(4-6247)]、對照組[435(3-9863)]無顯著差異(P>0.05)。
　　2.4. BLMPs數(shù)目變化情況:

13、AECOPD組BLMPs數(shù)目[46(6-1012)]明顯低于對照組[237(1-4685)]和 COPD穩(wěn)定期組[114.5(37-876)](P<0.05);而 COPD穩(wěn)定期組BLMPs數(shù)目與對照組相比不具有統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05)。多組間比較,BLMPs數(shù)目具有顯著差異(P<0.05)。
　　2.5. PMPs數(shù)目變化情況:AECOPD組PMPs的數(shù)目[81(29-370)]顯著低于COPD穩(wěn)定期組[378.5(56-12

14、60)]和對照組[623.5(74-1531)](P<0.05),而 COPD穩(wěn)定期組與對照組相比PMPs數(shù)目無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05)。多組間比較,PMPs數(shù)目有顯著差異(P<0.05)。
　　2.6. EMPs數(shù)目變化情況:AECOPD組EMPs數(shù)目[202(12-1873)]顯著低于COPD穩(wěn)定期組[493(124-1892)]和對照組[693.5(43-1847)](P<0.05),而 COPD穩(wěn)定期組與對照組相比EMP

15、s數(shù)目無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05)。多組間比較,EMPs數(shù)目有顯著差異(P<0.05)。
　　3.COPD患者BALF中幾種微粒數(shù)目變化的相關(guān)性分析
　　對三組中各種微粒之間的數(shù)目變化關(guān)系進(jìn)行相關(guān)性分析發(fā)現(xiàn):在AECOPD組中, BLMPs數(shù)目變化與CD4+TLMPs數(shù)目變化呈低度負(fù)相關(guān)(rs=-0.344, P<0.05),其余幾種微粒數(shù)目的變化之間無明確相關(guān)性(P>0.05)。在COPD穩(wěn)定期組中,PMPs數(shù)目變化與BL

16、MPs數(shù)目變化呈顯著正相關(guān)(rs=0.755, P<0.05),其余幾種微粒之間數(shù)目變化無明確相關(guān)性( P>0.05)。而對照組中,幾種微粒兩兩之間其數(shù)目變化均無相關(guān)性(P>0.05)。
　　4.COPD患者BALF中微粒數(shù)目變化與年齡、性別、體表面積及吸煙狀況的關(guān)系:AECOPD組及COPD穩(wěn)定期組患者BALF中6種微粒數(shù)目變化與年齡、性別、體表面積及吸煙與否均無關(guān)(P>0.05)。
　　結(jié)論:
　　1.COPD患者

17、BALF中BLMPs、EMPs、PMPs數(shù)目明顯減少,而MMPs、CD8+TLMPs數(shù)目明顯增多,且這種變化在AECOPD患者中更為明顯。提示這幾種微粒數(shù)目的變化可能與COPD疾病分期有關(guān)。
　　2.COPD患者BALF中CD4+TLMPs數(shù)目與對照人群相比無明顯變化。
　　3.AECOPD患者BALF中 BLMPs數(shù)目減少與CD4+TLMPs數(shù)目呈負(fù)相關(guān);而在COPD穩(wěn)定期患者BALF中,PMPs數(shù)目減少與BLMPs數(shù)目的