DLC2生理學(xué)特性及其與血管生成相關(guān)性的研究.pdf

1、研究背景：黏著斑(focal adhesion)是一個(gè)以整合素(integrin)為中心的蛋白分子復(fù)合體，整合素的胞內(nèi)段與肌動(dòng)蛋白細(xì)胞骨架(微絲)接合，胞外段與細(xì)胞外基質(zhì)(extracellular matrix,ECM)結(jié)合，從而實(shí)現(xiàn)細(xì)胞和細(xì)胞外基質(zhì)的相互黏附，并參與信號(hào)胞內(nèi)轉(zhuǎn)導(dǎo)，調(diào)節(jié)細(xì)胞遷移、增殖、分化、死亡和基因表達(dá)。整合素胞內(nèi)段與肌動(dòng)蛋白(actin)的接合必需借助于一系列蛋白，這些蛋白被稱為黏著斑相關(guān)蛋白。DLC(Delete

2、d in liver cancer)蛋白亞家族即屬于黏著斑相關(guān)蛋白。DLC目前有三個(gè)成員：DLC1、DLC2和DLC3，它們具有相似的蛋白結(jié)構(gòu)：由SAM功能域、RhoGAP功能域和START功能域組成。DLC含有RhoGAP功能域，因而也屬于Rho GTP酶激活蛋白家族(Rho GAPs)，這些蛋白的主要功能與其RhoGTP酶蛋白(RhoGAP)活性有關(guān)。DLC1是DLC第一個(gè)成員，對(duì)它的研究也最全面。DLC1是在對(duì)肝癌染色體缺失片段的

3、研究中被發(fā)現(xiàn)并克隆的。DLC1被認(rèn)為屬于抑癌基因，與多種腫瘤的發(fā)生、發(fā)展有關(guān)。DLC1參與調(diào)節(jié)細(xì)胞形態(tài)、黏附、遷移、增殖和死亡。在DLC1缺失的細(xì)胞中重表達(dá)DLC1可有效的抑制細(xì)胞生長(zhǎng)。DLC1基因敲除小鼠胚胎在10.5dpe(dayspost coitum)后不能存活。DLC2，別名STARD13，于2003年被成功克隆，它與DLC1有相似的蛋白結(jié)構(gòu)，也在多種腫瘤中表達(dá)下調(diào)，亦可通過(guò)其RhoGAP結(jié)構(gòu)域抑制腫瘤細(xì)胞的生長(zhǎng)，因而也被認(rèn)為

4、是一個(gè)潛在的抑癌基因。但是，DLC2在功能上是否與DLC1有不同，是否是一個(gè)冗余基因，我們尚無(wú)答案。目前對(duì)于DLC2的研究尚處起步階段，尚未建立DLC2表達(dá)譜，對(duì)DLC2的潛在抑癌作用機(jī)制和其它生理學(xué)功能的了解也非常貧乏。
　　 研究?jī)?nèi)容：在本研究中，我們擬對(duì)DLC2的基本生物學(xué)特征進(jìn)行較全面的研究，包括建立DLC2基因敲除小鼠模型；借助基因報(bào)告-敲除系統(tǒng)，描繪小鼠體內(nèi)DLC2的表達(dá)譜，同時(shí)研究DLC2基因缺失后對(duì)小鼠體內(nèi)血管生

5、成等的影響。此外，我們還要在上述研究結(jié)果的基礎(chǔ)上進(jìn)一步研究DLC2在內(nèi)皮細(xì)胞中的功能以及它與血管生成之間的關(guān)系，并探討了DLC2調(diào)控血管生成的機(jī)制，為明確DLC2的生理學(xué)功能和抑癌作用機(jī)制，以及將DLC2應(yīng)用于抗腫瘤治療的靶點(diǎn)奠定了理論基礎(chǔ)。
　　 本研究分為四個(gè)部分：
　　 第一章 DLC2基因結(jié)構(gòu)、序列特征和表達(dá)特點(diǎn)。
　　 目的：了解DLC2的基本生物學(xué)特征和表達(dá)情況。
　　 方法：⑴通過(guò)生物信息學(xué)

6、方法分析DLC2基因結(jié)構(gòu)和分子序列的特征；⑵采用實(shí)時(shí)定量PCR在mRNA水平檢測(cè)小鼠各個(gè)組織器官中DLC2的表達(dá)情況；⑶采用實(shí)時(shí)定量PCR在mRNA水平檢測(cè)人惡性腫瘤eDNA樣本(腎癌、肺癌、乳腺癌、前列腺癌、結(jié)腸癌、卵巢癌、胃癌和食管癌)中DLC2的表達(dá)情況；⑷制備特異性抗DLC2抗體，在蛋白水平檢測(cè)結(jié)腸癌、乳腺癌和前列腺癌細(xì)胞系中DLC2的表達(dá)情況；⑸構(gòu)建GFP-DLC2融合蛋白，研究DLC2的亞細(xì)胞定位。
　　 結(jié)果及結(jié)論

7、：①DLC2屬于Rho GTPase-activating proteins(GAPs)家族成員，它的蛋白分子結(jié)構(gòu)中包括SAM、RhoGAP和START三個(gè)結(jié)構(gòu)域，DLC2的生理學(xué)功能可能與RhoGAP結(jié)構(gòu)域活性密切相關(guān)；②DLC2在小鼠肺組織中有較高轉(zhuǎn)錄水平，在脾和骨骼肌中無(wú)表達(dá)；③DLC2在人乳腺癌和前列腺癌中表達(dá)下調(diào)，提示DLC2可能作為抑癌基因參與乳腺癌和前列腺癌的發(fā)生、發(fā)展過(guò)程；④DLC2通過(guò)N'端定位于黏著斑，包括SAM結(jié)構(gòu)

8、域、FAT結(jié)構(gòu)序列，但具體負(fù)責(zé)結(jié)合的部位和酪氨酸位點(diǎn)尚需進(jìn)一步研究。
　　 第二章 DLC2基因敲除小鼠模型的建立和DLC2組織分布特點(diǎn)。
　　 目的：建立DLC2基因敲除小鼠模型，觀察DLC2缺失表型及DLC2表達(dá)特征，從中推測(cè)DLC2的生理學(xué)功能。
　　 方法：⑴在小鼠胚胎干細(xì)胞中通過(guò)同源重組的原理用敲除靶載體取代內(nèi)源DLC2基因，建立DLC2基因敲除小鼠模型；⑵采用PCR方法分析小鼠基因型并觀察DLC2基因

9、敲除小鼠的表型；⑶采用免疫沉淀方法確定DLC2在基因敲除小鼠模型中完全缺失；⑷采用X-Gal染色檢測(cè)DLC2在小鼠各個(gè)組織器官中的原位表達(dá)情況；⑸采用連續(xù)切片X-gal、CD31免疫組織化學(xué)染色確定DLC2在血管中的表達(dá)定位。
　　 結(jié)果及結(jié)論：①DLC2基因報(bào)告-敲除小鼠模型構(gòu)建成功；②DLC2基因敲除小鼠可正常發(fā)育、成年和繁殖，未發(fā)現(xiàn)異常表型，提示DLC2對(duì)小鼠的生長(zhǎng)發(fā)育繁殖可能不是必需的；③DLC2在小鼠肺、肝等組織高表達(dá)

10、；④DLC2在小鼠內(nèi)皮細(xì)胞中高表達(dá)，提示DLC2可能參與血管生成反應(yīng)過(guò)程。
　　 第三章 DLC2與血管生成關(guān)系的觀察。
　　 目的：利用DLC2基因敲除小鼠模型，觀察DLC2與血管生成的關(guān)系，探討DLC2在小鼠內(nèi)皮細(xì)胞中高表達(dá)的生理學(xué)意義。
　　 方法：⑴通過(guò)基質(zhì)膠血管生成誘導(dǎo)實(shí)驗(yàn)和動(dòng)脈環(huán)種植實(shí)驗(yàn)，觀察DLC2缺失對(duì)內(nèi)皮細(xì)胞遷移和血管生成的作用；⑵通過(guò)小鼠皮膚創(chuàng)傷實(shí)驗(yàn)觀察DLC2缺失對(duì)創(chuàng)傷誘導(dǎo)的血管生成的作用；

11、⑶建立B16腫瘤移植模型，觀察DLC2缺失對(duì)腫瘤誘導(dǎo)的血管生成的作用。
　　 結(jié)果及結(jié)論：DLC2基因敲除小鼠對(duì)基質(zhì)膠和腫瘤細(xì)胞誘導(dǎo)的血管生成反應(yīng)較野生型小鼠強(qiáng)，但是DLC2基因敲除小鼠對(duì)創(chuàng)傷誘導(dǎo)的血管生成與野生型小鼠對(duì)比無(wú)明顯差異，說(shuō)明DLC2參與某些類型血管生成反應(yīng)，如腫瘤誘導(dǎo)的血管生成過(guò)程。
　　 第四章 DLC2缺失促進(jìn)血管生成機(jī)制的探討。
　　 目的：探討DLC2缺失是否通過(guò)影響內(nèi)皮細(xì)胞遷移和黏附能力而

12、參與調(diào)控血管生成的過(guò)程；RhoGAP是否是DLC2實(shí)現(xiàn)功能調(diào)控的關(guān)鍵機(jī)制。
　　 方法：⑴采用RNAi技術(shù)沉默DLC2在內(nèi)皮細(xì)胞系HUVEC中的表達(dá)，觀察DLC2缺失對(duì)內(nèi)皮細(xì)胞黏附、遷移和小管形成能力的影響；⑵采用雙重RNAi技術(shù)觀察RhoA活性的下調(diào)對(duì)DLC2缺失表型的逆轉(zhuǎn)。
　　 結(jié)果及結(jié)論：①在內(nèi)皮細(xì)胞中沉默DLC2可削弱細(xì)胞黏附能力，促進(jìn)細(xì)胞遷移和小管形成；②以上作用可被RhoA沉默逆轉(zhuǎn)，表明DLC2對(duì)血管生成的

13、調(diào)控是通過(guò)RhoA途徑實(shí)現(xiàn)的。
　　 全文小結(jié)：DLC2屬Rho GTP酶激活蛋白，它定位于黏著斑，并且在血管內(nèi)皮細(xì)胞中高表達(dá)。DLC2對(duì)于小鼠胚胎的發(fā)育并非必需，但是它通過(guò)影響內(nèi)皮細(xì)胞黏附、遷移和小管形成能力，參與血管生成的調(diào)控，此調(diào)控是通過(guò)其RhoGAP活性實(shí)現(xiàn)的。本研究第一次闡述了DLC2和血管生成的關(guān)系，揭示了DLC亞家族在生理學(xué)上的新功能，為黏著斑參與細(xì)胞生理學(xué)功能的調(diào)控做出了更進(jìn)一步的分析，也為DLC2應(yīng)用于抗腫瘤靶