基于受體—配體空間構(gòu)象信息設(shè)計(jì)IL-6拮抗多肽.pdf

1、自從1997年William等通過X射線晶體衍射分析確定了人IL-6的三維結(jié)構(gòu)以來，人們在人IL-6及其受體拮抗劑的研究方面已經(jīng)取得了一定成果，但因其特異性差，且不能安全、長期、有效地抑制體內(nèi)IL-6的活性，所以限制了它們在臨床上的應(yīng)用。本研究擬根據(jù)IL-6/sIL-6R/gp130相互作用復(fù)合物的三維結(jié)構(gòu)，通過距離幾何學(xué)、分子間氫鍵形成理論探討IL-6與其受體(IL-6R、gp130)的作用模式，借助虛擬篩選與計(jì)算機(jī)輔助合理設(shè)計(jì)相結(jié)合

2、的方法，合理篩選獲得IL-6小分子拮抗肽，初步建立基于受體—配體相互作用空間構(gòu)象設(shè)計(jì)配體拮抗劑的可行性方案。同時(shí)，針對(duì)設(shè)計(jì)的IL-6小分子拮抗肽，從實(shí)驗(yàn)上對(duì)合成短肽的體外生物學(xué)活性進(jìn)行了評(píng)價(jià)，希望為臨床治療IL-6相關(guān)疾病提供更有效的先導(dǎo)化合物。研究內(nèi)容具體如下： 一.IL-6小分子拮抗肽的設(shè)計(jì) 根據(jù)IL-6/sIL-6R/gp130相互作用復(fù)合物的三維結(jié)構(gòu)，通過計(jì)算機(jī)圖形學(xué)技術(shù)、距離幾何學(xué)、分子問氫鍵作用確定hIL-6

3、/hIL-6R/gp130相互作用的功能域，理論分析影響配基—受體作用的功能域結(jié)構(gòu)信息及其作用模式。利用位點(diǎn)連接法計(jì)算機(jī)輔助設(shè)計(jì)hIL-6拮抗肽，從頭搭建拮抗肽空間構(gòu)象，經(jīng)分子力學(xué)、動(dòng)力學(xué)優(yōu)化獲得的拮抗肽穩(wěn)定構(gòu)象與受體IL-6R進(jìn)行分子對(duì)接，從理論上構(gòu)建拮抗肽/hIL-6R相互作用復(fù)合物空間結(jié)構(gòu)并對(duì)IL-6拮抗肽進(jìn)行生物學(xué)功能評(píng)價(jià)。 二、IL-6小分子拮抗肽生物學(xué)功能評(píng)價(jià) ①通過MTT法、3H-TdR摻入法初步驗(yàn)證IL-

4、6小分子拮抗肽的活性。選擇IL-6依賴型細(xì)胞系—人多發(fā)性骨髓瘤細(xì)胞XG-7通過細(xì)胞學(xué)方法檢測拮抗肽對(duì)其增殖的影響，進(jìn)而評(píng)價(jià)其對(duì)IL-6活性的影響。結(jié)果表明，設(shè)計(jì)的IL-6小分子拮抗肽能夠有效抑制IL-6對(duì)XG-7細(xì)胞的增殖促進(jìn)作用，顯示拮抗肽在細(xì)胞水平能夠較好地抑制IL-6的生物學(xué)活性。 ②通過BindingAssay法檢測了IL-6小分子拮抗肽對(duì)IL-6與IL-6R的競爭抑制效應(yīng)。結(jié)果表明，IL-6小分子拮抗肽能夠特異性抑制I

5、L-6/sIL-6R的結(jié)合。 ③通過流式細(xì)胞術(shù)分析IL-6小分子拮抗肽對(duì)細(xì)胞凋亡和細(xì)胞周期的影響。選擇XG-7細(xì)胞，當(dāng)IL-6在濃度為2ng/ml時(shí)即可使其增殖達(dá)到頂峰，而IL-6不存在時(shí)細(xì)胞將產(chǎn)生凋亡。將不同濃度的短肽作用于細(xì)胞，分析其不同劑量對(duì)XG-7細(xì)胞細(xì)胞周期的影響。結(jié)果表明，隨著IL-6拮抗肽濃度的逐漸升高，細(xì)胞增殖逐漸減少，細(xì)胞凋亡比例逐漸增加，說明此拮抗肽在一定程度上能夠拮抗IL-6的生物學(xué)活性。 ④通過免

6、疫組化染色法分析IL-6小分子拮抗肽對(duì)IL-6細(xì)胞內(nèi)信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)的影響。將不同濃度的IL-6拮抗肽作用于人肝癌細(xì)胞系HepG2細(xì)胞后，利用IL-6誘導(dǎo)細(xì)胞，通過APAAP方法對(duì)其進(jìn)行免疫組化染色分析。結(jié)果表明，隨著肽溶液濃度的升高，細(xì)胞染色的數(shù)量逐漸減少，染色強(qiáng)度逐漸減弱，提示IL-6拮抗肽能夠通過阻遏細(xì)胞內(nèi)gp130的JAK/STAT信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路來抑制IL-6的生物學(xué)活性。 本文的研究表明，基于IL-6/IL-6R/gp130復(fù)合