白三烯受體拮抗劑對UUO大鼠JAK2、STAT3、IL-6及Ⅲ型膠原表達的影響.pdf

1、目的：
　　腎間質(zhì)纖維化（renal interstitial fibrosis,RIF）是各種病因所致慢性腎臟?。╟hronic kidney diseases,CKD）發(fā)生發(fā)展的共同病理表現(xiàn)，是發(fā)展至終末期腎臟病(end-stage renal disease，ESRD)的關(guān)鍵過程。腎間質(zhì)纖維化的病理過程包括腎小管間質(zhì)纖維化和晚期的腎小球硬化，表現(xiàn)為炎癥細胞浸潤、細胞因子激活，腎小管上皮間充質(zhì)轉(zhuǎn)分化，成纖維細胞增殖，細胞外基質(zhì)

2、沉積，細胞凋亡，最終導(dǎo)致終末期腎衰竭。隨著對CKD研究的不斷發(fā)展，發(fā)現(xiàn)許多細胞因子和生長因子與CKD的病理生理過程有關(guān)，如轉(zhuǎn)化生長因子β(transforming growth factorβ1,TGF-β1)，基質(zhì)金屬蛋白酶（matrix metalloproteinases, MMP），瘤壞死因子α（tumor necrosis factorα，TNF-α）等，不同程度的參與了CKD的發(fā)病過程。而JAK/STAT（The Janus

3、 kinase family/signal transducers and activators of transcription）通路是一條由多種細胞因子和生長因子介導(dǎo)的信號轉(zhuǎn)導(dǎo)通路，對疾病的發(fā)生發(fā)展有重要的調(diào)控作用，其激活能促進各種疾病的進展，如淋巴瘤、白血病及各種炎癥性疾病。已有研究表明，JAK/STAT信號通路與糖尿病腎病、梗阻性腎病、多囊腎等腎臟疾病的病理生理過程有著密切的聯(lián)系。已證明,JAK/STAT信號通路與炎癥的進展關(guān)系

4、密切,既可以調(diào)控自身下游炎癥相關(guān)基因的表達，又可通過參與不同的信號通路發(fā)揮其生物學功能，如轉(zhuǎn)化生長因子β（TGF-β)和核因子κ B（NF-κ B)等通路。同時，巨噬細胞通過 JAK/STAT通路的信號轉(zhuǎn)導(dǎo)作用可誘導(dǎo)多種炎癥因子的激活。因此JAK/STAT信號通路對機體炎癥反應(yīng)過程的調(diào)節(jié)作用尤為關(guān)鍵。
　　白三烯（Leukotrienes，LTs）是一類擁有高度生物活性的炎癥介質(zhì)，在體內(nèi)由炎性細胞產(chǎn)生，與其相關(guān)的受體也是重要的炎癥

5、介質(zhì)，大量存在于炎性細胞顆粒蛋白中。目前研究發(fā)現(xiàn)，多種病理因素刺激可誘導(dǎo) LTs在腎臟中的表達增強，從而在腎損害中發(fā)揮重要作用。因此，抑制 LTs的過度表達可能對腎臟病的治療起到有益的作用。孟魯司特（montelukast， MON，商品名：順爾寧）是一種高選擇性半胱氨酰白三烯（Cys-LT）受體拮抗劑，在臨床作為預(yù)防和治療哮喘的一種非激素類抗炎藥物被推廣應(yīng)用。
　　本實驗的目的是觀察白三烯受體拮抗劑是否可延緩單側(cè)輸尿管梗阻（Un

6、ilateral Ureteral Occlusion，UUO）大鼠腎間質(zhì)纖維化的進展，及其對UUO大鼠JAK2，STAT3，IL-6及Ⅲ型膠原蛋白表達的影響，探究其是否通過JAK/STAT信號通路發(fā)揮抗腎間質(zhì)纖維化作用，為腎間質(zhì)纖維化的臨床治療提供新的理論基礎(chǔ)及治療靶點。
　　方法：
　　采用單側(cè)輸尿管梗阻模型，54只清潔級SD大鼠（雄性210±20g），隨機分為A、B、C三組，假手術(shù)組（A組，Sham組）18只，模型組（

7、單側(cè)輸尿管結(jié)扎組，B組，UUO組）18只，治療組（孟魯司特干預(yù)組，C組，MON組）18只，適應(yīng)性喂養(yǎng)7天，按分組不同建立單側(cè)輸尿管梗阻模型。各組大鼠均于術(shù)前24小時開始給藥，治療組每天給予孟魯司特10mg/kg/d灌胃，同時Sham組和UUO組給以等容生理鹽水灌胃。自由進食飲水，分別于術(shù)后3、7、14天，每組各取6只大鼠，取左腎組織后處死，用0.9％的生理鹽水反復(fù)沖洗，取中間1/4組織塊于多聚甲醛中固定，用于病理切片，進行HE、Mass

8、on染色及免疫組織化學染色，其余腎組織放于液氮中迅速冷凍，以防止蛋白降解，并保存于-80℃冰箱中，行Western blot實驗。使用SPSS20.0統(tǒng)計分析軟件對所得的實驗數(shù)據(jù)進行統(tǒng)計學分析，以均數(shù)±標準差（x±S）表示統(tǒng)計結(jié)果，使用單因素方差分析對數(shù)據(jù)進行分析，P＜0.05表示結(jié)果有統(tǒng)計學意義。
　　結(jié)果：
　　1腎臟組織病理學染色
　　1.1光鏡下HE染色：A組：第3、7、14天，腎小球、腎小管及間質(zhì)未見明顯異常

9、。B組：術(shù)后3天，腎小管發(fā)生輕度擴張，間質(zhì)中可見少量炎癥細胞浸潤；術(shù)后7天腎小管管腔擴張程度和間質(zhì)炎癥細胞浸潤程度加重，腎小管上皮細胞脫落，空泡樣變性；術(shù)后14天可觀察到大量腎小管萎縮，腎小管基底膜增厚，皺縮，失去正常結(jié)構(gòu)。C組：與同時期B組相比，病變程度較輕，但仍明顯重于A組。
　　1.2光鏡下Masson染色：A組：第3、7、14天腎小球、腎小管及間質(zhì)未見異常。B組：腎小管廣泛擴張，腎間質(zhì)較前增寬，可見膠原纖維沉積，隨梗阻時間

10、的延長，膠原纖維逐漸向腎小管周圍延伸，交織成網(wǎng)狀“結(jié)構(gòu)”。C組：與同期B組相比，腎間質(zhì)膠原纖維沉積程度減輕，但仍明顯重于A組。
　　2腎組織免疫組織化學染色
　　2.1 P-JAK2
　　A組：腎小管上皮細胞胞漿P-JAK2散在表達。B組：大鼠腎小管上皮細胞胞漿內(nèi)陽性表達顯著增加。隨著梗阻時間的延長，其表達水平呈進行性增高，且與A組同時期相比均有統(tǒng)計學意義（P均＜0.05）。C組：P-JAK2表達水平與同時期B組相比均

11、有顯著下降（P均＜0.05），但仍高于同時期A組中的表達水平（P均＜0.05）。
　　2.2 P-STAT3
　　A組：在腎小管上皮細胞核幾乎不表達。B組：與A組相比，P-STAT3在大鼠腎小管上皮細胞核內(nèi)表達增加。隨著病變時間的延長，腎小管上皮細胞核中出現(xiàn)表達逐漸增加。與A組同時期相比均有統(tǒng)計學意義（P均＜0.05）。C組：術(shù)后第3、7、14天，與同時期B組相比，腎小管上皮細胞核表達水平降低（P均＜0.05）。但與A組同時

12、期相比，表達水平均較高（P均＜0.05）。
　　2.3 IL-6
　　A組：腎小管上皮細胞胞漿中微量表達。B組：細胞胞漿中陽性表達明顯增加，隨著病變的進展，表達水平持續(xù)增加，與同一時期 A組相比均有統(tǒng)計學差異（P均＜0.05）。C組：與同時期B組相比，術(shù)后第3、7、14天，IL-6表達水平明顯下降（P均＜0.05）；但與A組同時期相比，表達水平均高于A組（P均＜0.05）。
　　2.4Ⅲ型膠原
　　A組：正常情況

13、下Ⅲ型膠原在腎小球系膜細胞胞漿、腎小管上皮細胞以及間質(zhì)細胞中有少量表達。B組：腎小管上皮細胞表達水平增加，腎間質(zhì)表達不明顯，隨梗阻時間延長表達增加（P均＜0.05）。且表達水平均高于同時期A組（P均＜0.05）。C組：Ⅲ型膠原表達水平與同時期B組相比均有顯著下降（P均＜0.05），但仍高于同時期A組中的表達水平（P均＜0.05）。
　　3腎組織中P-JAK2、P-STAT3 Western Blot結(jié)果
　　P-JAK2蛋白

14、：B組術(shù)后3、7、14天P-JAK2蛋白的表達量逐漸增加（P均＜0.05），與同期A組相比，表達量均增加（P均＜0.05）；C組術(shù)后各時期P-JAK2蛋白表達量隨梗阻時間延長逐漸增加（P均＜0.05），與同時相B組相比較表達量減少（P均＜0.05），但仍高于同時相A組（P均＜0.05）。
　　P-STAT3蛋白：與同期A組相比，B組和C組術(shù)后3、7、14天目的蛋白的表達量均增加（P均＜0.05），并隨梗阻時間的延長表達量逐漸增加（

15、P均＜0.05），C組術(shù)后各時期P-STAT3蛋白表達量隨時間延長逐漸增加（P均＜0.05），與同時相B組相比較表達量減少（P均＜0.05），但仍高于同時相A組（P均＜0.05）。
　　結(jié)論：
　　1 JAK2/STAT3信號通路可能參與了UUO大鼠模型腎間質(zhì)纖維化的進展。
　　2在UUO大鼠模型中，白三烯受體拮抗劑可能具有抗纖維化作用，其機制可能是通過降低炎癥因子的表達，從而抑制JAK2/STAT3信號通路的激活而實