秦巴山區(qū)虎杖中產(chǎn)白藜蘆醇(苷)內生真菌的分離鑒定.pdf

1、植物內生真菌(plant endophytic fungi)是指在其部分或全部生活史中存活于健康植物組織內部、不引發(fā)宿主植物表現(xiàn)出明顯感染癥狀的一類真菌。自Strobel.等于1993年首次從短葉紫杉(Taxus brevifolia)樹皮中分離出一株內生真菌(Taxomycesandreanae)能產(chǎn)生紫杉醇(taxol)后，利用微生物發(fā)酵被認為是解決植化藥物短缺的潛在途徑?；⒄龋≒olygonurn cuspidatum）是秦巴山區(qū)

2、一種廣泛分布的中藥材，其活性成分白藜蘆醇（苷）具有抗癌、抑菌消炎、保肝利膽、抗氧化和降血脂等多方面的藥理活性。本研究以虎杖為材料，分離得到了一些內生真菌，通過對菌株的分類鑒定和代謝產(chǎn)物的初步分析表明，部分內生真菌能發(fā)酵產(chǎn)生白藜蘆醇苷（醇），具體研究結果如下。
　　 1虎杖內生真菌的分離、純化及初步分類鑒定
　　 采用組織分離法，將新鮮虎杖根清洗干凈，并對其表面進行消毒后，剪切成0.5mm×0.5mm的小塊，接入PDA平板

3、中，于28℃培養(yǎng)3～7d，分離、純化得到116株內生真菌。形態(tài)分類結果初步表明，它們分別屬于從梗孢目、殼霉目、黑盤孢目、毛霉目和無孢目5目，及曲霉屬（Aspergillus）、青霉屬（Penicillium）、無孢類(Agonomycetaceae)、鐮孢霉屬（Fusarium）、毛霉屬(Mucor)、擬盤多毛孢屬(Pestalotia)、枝孢霉屬（Cladosporium）、鏈隔孢屬(Alternaria)及木霉屬（Trichoder

4、ma）9屬。
　　 2產(chǎn)白藜蘆醇（苷)虎杖內生真菌的篩選
　　 將上述116菌株（還是部分代表菌株），分別接種于改良馬鈴薯液體培養(yǎng)基中，28℃，160r/min，培養(yǎng)7d后，按1:2(v/v或w/v)的比例，以乙酸乙酯分別對菌絲和發(fā)酵液萃取15min，合并萃取液，40℃真空旋轉蒸發(fā)至干后，以甲醇溶解、定容至25mL，并以HPLC測定提取液中白藜蘆醇（苷）的含量。獲得兩株可產(chǎn)白藜蘆醇（苷）的內生真菌，分別為M-56和L-1

5、8。其中，M-56只產(chǎn)白藜蘆醇苷，產(chǎn)量為1.029mg/L；L-18既產(chǎn)白藜蘆醇苷又產(chǎn)白藜蘆醇，含量分別為4.672和4.812mg/L。
　　 3產(chǎn)白藜蘆醇（苷）虎杖內生真菌的鑒定
　　 根據(jù)菌落形態(tài)及顯微形態(tài)的觀察結果，將M-56和L-18菌株初步鑒定為鏈格孢屬(Alternaria)和青霉屬(Penicillium)真菌。在此基礎上，對兩菌株的ITS片段進行擴增，得到長度均為564bp的DNA片段。經(jīng)測序并在NCB